摘要：纤维素的降解是自然界中最重要的反应之一，也是生物质转化为燃料和化学品的核心过程。然而，纤维素的微纤维结构以及它与植物细胞壁其他成分的复杂相互作用，使得酶促转化面临着巨大的挑战。在这项研究中，我们通过挖掘一种专门降解木质纤维素的微生物群落中的宏基因组“暗物质”(

研究论文

● 期刊：Nature (IF:50.5)

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● 发表日期：2025-2-12

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摘要Abstract

纤维素的降解是自然界中最重要的反应之一，也是生物质转化为燃料和化学品的核心过程。然而，纤维素的微纤维结构以及它与植物细胞壁其他成分的复杂相互作用，使得酶促转化面临着巨大的挑战。在这项研究中，我们通过挖掘一种专门降解木质纤维素的微生物群落中的宏基因组“暗物质”(未分类、功能未知的DNA)，发现了一种金属酶，它能氧化性地裂解纤维素。这种金属酶通过外切型机制作用于纤维素，具有C1位的区域选择性，只生成纤维二糖酸(cellobionic acid)作为产物。其晶体结构显示，催化铜离子被埋藏在一个紧凑的果冻卷结构中，并具有一个扁平的纤维素结合位点。这种金属酶呈现同源二聚体结构，使得一个亚基在反应过程中生成过氧化氢，而另一个亚基则与纤维素进行有效的相互作用。表达这种金属酶的改造木霉(Trichoderma reesei)菌株的分泌物，在工业条件下，显著提高了预处理木质纤维素生物质中的葡萄糖释放，展示了其生物技术应用潜力。这一发现改变了我们对细菌氧化还原酶系统的现有认知，特别是它们在解决生物质降解的顽固性方面的作用。此外，这一发现还为农业工业废料的转化提供了新的途径，有助于推动向可持续和生物基础经济的转型。

结果Results

一种纤维素氧化裂解酶

为了识别以前未被描述的生物质活性微生物和生物催化剂，我们对长期在生物炼制厂(巴西圣保罗州Quatá)中覆盖甘蔗渣的土壤样本进行了宏基因组分析。结果显示，与甘蔗渣堆附近原生植被的土壤样本(约2,200个操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs))相比，这一环境中的微生物多样性显著下降，仅剩约1,000个OTUs(图1a，b及补充图1)。此外，微生物多样性的下降伴随着与多糖降解和代谢相关的宏基因组组装基因组(metagenome-assembled genomes, MAGs)数量增加，表明微生物在木质纤维素降解方面的特化(扩展数据图1a及补充图2)。

图1 | 甘蔗渣长期覆盖的土壤的宏基因组

a，采样地点，标示出覆盖有甘蔗渣的区域以及采集了原土样本的相邻区域。SBS，甘蔗渣覆盖土壤。

b，α多样性指数显示，甘蔗渣覆盖土壤的微生物多样性较原土土壤显著降低。

c，系统发育树，展示了回收的124个宏基因组组装基因组(MAGs)之间的关系。未描述过的基因组在分类学上用紫色星号标出。

d，预测的代谢途径、糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)以及新描述的CelOCE在‘Candidatus Telluricellulosum braziliensis’中的功能，突出了其在纤维素转化中的潜在作用。与CAZy数据库(https://www.cazy.org/)中已知糖苷水解酶(GHs)序列相似度低于30%的GHs，或那些与预测的家族匹配但不符合亚家族的GHs，标示为红色。与其GH家族或亚家族分类一致的预测酶活性，按酶学委员会(EC)编号标注在括号内。

在回收的高质量宏基因组组装基因组(MAGs)中(图1c及附表1和2)，我们进一步研究了一个来自最近提出的、未表征的并且未培养的细菌门4(uncultured bacterial phylum 4, UBP4)的成员，它在植物细胞壁降解方面展现了潜力。该潜力通过多个编码糖苷水解酶的基因得以体现，涉及GH3、GH5、GH9、GH39、GH43、GH44、GH74和GH148家族(图1d及扩展数据图1b)。虽然UBP4门最初是在废水中通过大规模宏基因组重建工作发现的，但我们在这里描述了一个来源于土壤的宏基因组组装基因组，它在家族水平上与GTDB数据库中已有的UBP4基因组有所不同(GTDB数据库)。根据其丰富的碳水化合物活性酶(CAZyme)基因组(图1d及扩展数据图1c)和巴西土壤来源，我们为这一未培养的细菌命名为“Candidatus Telluricellulosum braziliensis”(SeqCode, https://seqco.de/)。

通过使用隐藏马尔可夫模型进行远程同源性检测，我们从该基因组中挑选了8个序列，这些序列与已知的碳水化合物加工蛋白质具有至少10%的序列相似度，但在CAZy数据库中没有匹配项。我们合成并在大肠杆菌中表达了这些序列，随后对其进行了生化表征(附表3和4)。其中，一种蛋白质显示出能够提高预处理甘蔗渣的解聚效率(提高约21%)，作用方式是利用一个工业竞争性的里氏木霉(T. reesei)菌株生产的纤维素酶混合物(图2a)。这个真菌酶混合物包含了有效解聚纤维素和异木聚糖的关键酶活性，包括细胞二糖水解酶(CBH1和CBH2)、内切β-葡聚糖酶(EGL1、EGL2和EGL5)、LPMO(LPMO9A)、β-葡萄糖苷酶(来自Talaromyces emersonii的异源CEL3A)、内切β-木聚糖酶(XYN1、XYN2和XYN4)、β-木糖苷酶(BXL1)以及其他辅助酶(补充表5和6)。细菌酶能够增强优化真菌碳水化合物活性酶(CAZyme)混合物的效果，这一点值得关注，其在植物生物质降解中的潜力也不可小觑。

图2 | 功能和序列同源性

a. 当CelOCE与纤维素酶混合物联合使用时，能够增强预处理甘蔗渣、微晶纤维素和无定形纤维素的糖化效果。数据为三次独立实验的均值 ± 标准差(s.d.)。统计学显著性通过单因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验确定(**P

b. 含还原剂和酶CelOCE(深绿色线)、KdgF(橙色线)以及BacB(蓝色线)的反应的高效离子交换色谱和脉冲安培检测(HPAEC–PAD)图谱。控制条件包括仅甘蔗渣(深灰线)、仅ASC(灰线)、甘蔗渣与CelOCE无ASC(浅绿色线)、甘蔗渣与ASC(浅灰线)以及失活酶(灰蓝线)。标准C1氧化和非氧化的纤维二糖由黑线表示。DP为聚合度；ox为氧化。

纯化的蛋白质在广泛的底物上未显示可检测的水解活性，包括多糖、寡糖和合成底物(附表7)，这表明该酶可能具有非水解的作用机制，可能涉及氧化还原反应。因此，为了验证这一假设，我们分析了在氧化还原条件下，特别是在氧气和电子供体(抗坏血酸(ASC))存在下，从不同底物释放的产物。我们发现该酶仅从木质纤维素(预处理甘蔗渣)(图2b)、微晶纤维素(Avicel)(补充图4a)和无定形纤维素(PASC)(附图4b)中释放出一种产物，鉴定为纤维二糖酸(附图3)。对纤维寡糖(cellooligosaccharides)(C2–C6)和其他多糖(如几丁质、甘露聚糖、木聚糖、木聚糖半乳糖、阿拉伯木聚糖、混合链β-葡聚糖、海藻糖、地衣糖、淀粉和果胶)进行的活性测试未发现任何降解产物，表明该酶对纤维素类底物具有显著偏好(补充图4c–l)。尤其是该酶未与纤维二糖结合(补充图5)且在ASC存在下，16小时内未消耗纤维二糖(附图6)，排除了从纤维二糖生成纤维二糖酸的可能性。此外，该酶提高了同种Trichoderma酶混合物的糖化效率，微晶纤维素和无定形纤维素上的葡萄糖产率分别提高了约8%和12.5%(图2a)，支持其特定活性在纤维素转化中的作用。

通过亲和凝胶电泳(附图7)、傅里叶变换红外光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy, FTIR)(扩展数据图2a)和X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)(扩展数据图2b)等技术定性证明了该蛋白质结合纤维素的能力。此外，只有变性剂如SDS才能有效地将该酶从纤维素中解离(扩展数据图2a,b)。结合等温线显示，对于PASC(图2c)，解离常数在低微摩尔范围内(7–9µM)，而对于微晶纤维素(Avicel)(图2d)，则未达到饱和，这与已知的纤维素活性LPMOs类似。值得注意的是，铜的氧化还原状态对结合亲和力或最大结合能力(Bmax)影响较小，这可能是由于该酶中催化铜的埋藏性质。竞争结合实验进一步表明，该酶在牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)存在下，仍能保持较强的纤维素结合能力，类似于纤维素酶(附图8)。总体而言，这些纤维素结合实验突出了该发现的酶与纤维素的特定相互作用和高亲和力。

为了确定该酶的分类学分布，我们进行了序列相似性网络(sequence similarity network, SSN)和系统发育分析，发现许多与生物质降解相关的细菌门和古菌中，存在序列同源性大于30%的假设蛋白(扩展数据图3)。包括Bacteroides caccae、Draconibacterium halophilum、Rhodocytophaga rosea、Adhaeribacter swui和Lacunisphaera limnophila等物种中，都包含与纤维素降解相关的同源基因和CAZyme，如来自GH5、GH8和GH9家族的基因。

通过SSN分析(图2e)，我们确定了最接近的已知同源物，它们属于不同的同功能簇(序列同源性

我们的研究结果支持了发现一种来自之前未描述的细菌门的纤维素氧化裂解酶(CelOCE)。CelOCE通过一种前所未有的外切作用机制裂解纤维素，释放纤维二糖酸作为唯一产物。

同源二聚体单铜结构

为了阐明其氧化还原活性的机制，我们解析了CelOCE在三种不同状态下的晶体结构(扩展数据表1)。CelOCE呈现紧凑的果冻卷折叠结构，由两个反向平行的β-折叠片组成(扩展数据图4a)，并形成背对背的同源二聚体，活性位点位于对立面(图3a和扩展数据图4b)。这种二聚体结构通过广泛的β-折叠片相互作用得以稳定(扩展数据图4b和附表8)，并通过结合多角度光散射的分析尺寸排阻色谱法在溶液中进一步验证(附图9)，证明它是生物活性形式。

图3 | 晶体结构、铜属性与催化需求

a, 在CelOCE晶体结构中观察到的二聚体排列，突出显示了二聚体界面、活性位点位置(蓝色区域包含铜原子)以及纤维素结合位点(灰色区域)。

b, CelOCE晶体结构中的八面体铜配位球，展示了铜配位残基H44、H46、H84和Q50(以棒状表示)、铜原子(橙色球)和水分子(红色球)。虚线表示距离(单位为埃)。

c, CelOCE单体的表面表示，突出显示了平坦的催化界面，使其能够与纤维素相互作用。显示了参与该非常规界面的铜配位组氨酸和脯氨酸残基。还标出了残基F33，该残基可能参与活性位点口袋中的二糖识别。

d, CelOCE铜离子结合的等滴定量(ITC)数据。主图展示了结合等温线(绿色圆点)及其理论拟合(黑线)。右下方显示了热力学参数。左上角插图为热图。ΔG表示吉布斯自由能变化；ΔH表示焓变化；ΔS表示熵变化；T表示温度。

f, CelOCE在有氧和无氧条件下对纤维二糖酸生产的时间依赖性分析，以及电子供体(ASC)的作用。无氧反应在有无100 µM过氧化氢(H2O2)情况下，使用ASC进行。有氧反应在有无ASC的条件下进行。数据为三次独立实验的均值±标准差。

每个亚单位包含一个铜原子，位于一个扭曲的八面体配位结构中，涉及三个组氨酸(H44、H46和H84)、一个谷氨酰胺(Q50)和两个水分子(图3b)。在糖类模拟物甘油的存在下，其中一个水分子被甘油中的氧原子取代，另一个水分子被推向赤道平面，与H44、H46和Q50一起排列(扩展数据图5a)。在低pH(约pH 3.0)条件下，H44可能被质子化，并朝向溶剂翻转(扩展数据图5b)，这一行为与近期在LPMO中的报道相符。铜原子被埋藏在活性位点内，呈现出口袋状的拓扑结构，与LPMO的结构不同(图3c和扩展数据图6a)。此外，活性位点位于一个扁平的界面中，这一结构安排非常适合与纤维素的相互作用(图3c)。

CelOCE的EPR谱图表现为典型的+2氧化态铜中心轴向EPR特征(gz > gy ≈ gx, Az > Ay ≈ Ax)(图3e和附表9)。这与LPMO中常见的菱形EPR特征(gz ≠ gy ≠ gx, Az ≠ Ay ≠ Ax)5,34有所不同，表明CelOCE具有不同的配位结构。使用还原剂(ASC)的EPR对照实验显示信号显著减弱，表明铜被还原为EPR静默的Cu(I)形式(图3e)。此外，螯合剂EDTA也使EPR信号静默(附图12)，并显著降低了纤维二糖酸的生成(补充图13)，进一步证明了铜在催化中的关键作用。

电子供体和共同底物

接下来，我们试图了解这种纤维素氧化裂解活性的氧化还原要求。我们首先确认了它对电子供体的严格依赖，只有在还原剂(ASC)存在的情况下才会观察到产物的形成(图3f，扩展数据图7a和附图14)。这种还原步骤在氧化还原酶中已经得到充分证实，多种小分子和大分子的电子供体都能驱动如LPMO等酶的活性。

关于共同底物的需求，即使存在还原剂，该酶在没有氧气和过氧化氢的情况下也是无活性的(图3f，扩展数据图7b和附图15)。然而，CelOCE在厌氧条件下，存在ASC并补充外源过氧化氢时显示了活性，表明其具有过氧化酶活性(图3f和附图15)。该酶在有氧条件下(0.053±0.003 min⁻¹)和在有外源过氧化氢的厌氧条件下(0.050±0.003 min⁻¹)表现出相似的氧化产物形成转化率(图3f和扩展数据图7b)。这一结果出乎意料，因为LPMO在外源过氧化氢存在的情况下，活性比在氧气下高出几个数量级。这表明，CelOCE的原位过氧化氢生成并不是限制反应速率的因素。进一步的证据来自于过氧化氢生成的转化率(0.23±0.05 min⁻¹)，它比生成纤维二糖酸的转化率高出约四倍(附图16)，尽管反应的化学计量比为每消耗1摩尔过氧化氢生成1摩尔产物(扩展数据图7c)。值得注意的是，CelOCE的转化率与LPMO在有氧条件下对Avicel的作用时的典型转化率相似，且不需要添加外源过氧化氢(附表10)。考虑到它的非过程性(口袋状活性位点)和外向作用模式，特别是在仅作用于Avicel时，其效率天然受到纤维素末端低丰度的限制，这些末端是其催化活性的主要位点，因此这一转化率是可以预期的。

CelOCE作为一个同源二聚体，每个亚基的活性位点位于生物组装的对面，这一结构特点可能有助于其自给自足地生成过氧化氢。在这个模型中，当一个活性位点通过与纤维素相互作用而被溶剂保护时，另一个活性位点则可能处于自由状态，充当原位过氧化氢的供应者(图4a)，以确保过氧化氢在与纤维素结合的活性位点附近生成，并能被有效利用。支持这一机制的证据是，增加纤维素浓度并未抑制过氧化氢的生成(附图17)，而通过删除四个N末端残基来破坏二聚体(附图17和18)则导致过氧化氢生成的减少。

图4 | 纤维素识别与提出的裂解机制

a, 提出的模型展示了CelOCE与纤维素的同时相互作用及原位过氧化氢的生成。一个活性位点与纤维素链的非还原端结合，而同源二聚体的另一个活性位点则可能用于生成过氧化氢，这是纤维素氧化裂解所必需的共底物。

b, 纤维四糖(以球棒模型表示)被对接并在CelOCE结构中平衡，显示两个葡萄糖残基可以适配到活性位点口袋中。−1葡萄糖单元的C1碳处于有利位置，可以进行氧化攻击，生成细胞二糖酸作为唯一产物，这与生化数据一致。

综上所述，这些结果表明，在电子供体还原催化铜后，酶CelOCE准备催化一个过氧化酶反应，该反应通过一种创新的二聚化策略促进原位过氧化氢的生成。

纤维素的外切型机制

为了阐明该金属酶如何识别纤维素并进行氧化裂解的分子机制，我们进行了系列结构和计算分析。CelOCE展现了非常规的活性位点拓扑结构。催化铜位于一个由金属配位残基、一个酪氨酸(Y105)、一个苯丙氨酸(F33)、一个精氨酸(R102)、三个亮氨酸(L13、L14和L41)以及一个酸性残基(谷氨酸，E96)组成的口袋中，深约5 Å(扩展数据图6a)(补充图19)。计算结果表明，这个口袋足够大，能够容纳一个二糖分子(扩展数据图6b)，并且在立体化学上与葡糖基基团兼容(扩展数据图6c)。

在模拟的CelOCE与纤维二糖复合物中，非还原端的葡糖基(−2)残基主要通过E96和Q50的侧链进行锚定，而−1葡糖基残基则与F33堆叠，将C1原子合理地定位于催化铜附近(图4a、b和附图20)。虽然纤维素链的还原端在立体化学上似乎不利于观察到的C1选择性，但阐明底物-酶复合物对于实验验证酶的活性方向性至关重要(扩展数据图8)。为了验证这些计算预测，我们构建了F33A突变体，该突变体表现出催化活性受损(附图21)，进一步支持了所提出的结合模式(图4a和扩展数据图6c)，并且与仅释放纤维二糖酸作为唯一产物的结果一致(图4b)。在反应的整个过程中，仅检测到纤维二糖酸的产物，包括反应的早期阶段(图3f)，进一步证明了其外切型作用模式。

该机制的另一部分依赖于铜配位位点附近的暴露溶剂环的刚性，该环通过脯氨酸残基得以稳定。该环与C末端的α-螺旋和第二个N末端的β-链一起形成一个平坦的表面(图3c)。通常，表面环会变得柔性，并且很少形成平坦的表面；然而，由于这些脯氨酸残基和金属配位的存在，该环采用了一种独特的几何形状，立体化学上与纤维素的相互作用是兼容的(图3c)。这些脯氨酸残基在CelOCE的同源物中高度保守，形成了PXHXHP的模式，其中包括两个参与铜配位的组氨酸残基(H44和H46)(附图22)。

这两种独特的催化界面特征——口袋状的活性位点和平坦的表面拓扑结构，清晰地表明该酶采用外切型机制，这是碳水化合物活性氧化还原酶中前所未见的机制。

生物质转化中的协同作用

为了进一步探讨CelOCE在植物生物质转化中的作用，我们评估了它与关键纤维素酶的协同作用，包括GH539和GH4540内切葡聚糖酶以及GH7型葡萄糖二糖水解酶(Cel7A)。我们观察到，CelOCE与内切作用的纤维素酶之间存在显著的加成效应(提高约300%)，但与外切作用的Cel7A并未产生正向影响(图5a)。这种与Cel7A缺乏加成效应的现象，与CelOCE的外切作用模式相符，因为CelOCE不会生成新的纤维素末端。

图5 | 与经典纤维素酶的互补作用

a, 互补实验显示CelOCE与内切和外切纤维素酶在微晶纤维素上的协同作用。

b, 基因工程方法将编码CelOCE和L. similis AA9A的序列整合到T. reesei基因组中。

c, 在工业相关条件下，使用预处理甘蔗渣作为底物，工程化菌株生产的酶混合物的糖化效率。

a和c中的数据为三次独立实验的均值±标准差。在a中，统计显著性通过单因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验确定(***P

接下来，我们评估了CelOCE与T. reesei Br_TrR03工程化菌株(为木质纤维素生物炼制开发的菌株)生产的酶混合物的协同作用，模拟了工业条件。为此，我们采用定制的CRISPR-Cas9方法将编码CelOCE的基因序列整合进Br_TrR03的基因组中(图5b)。在工业相关条件下，这一工程化菌株生产的分泌蛋白组(补充图23和24)显著增加了葡萄糖的释放，分别在预处理的甘蔗渣和桉树材料中增加了21%和19%(图5c和扩展数据图9c)。质谱分析确认了分泌蛋白组中CelOCE的存在(附表11和12)，且在生物质糖化过程中观察到细胞二糖酸水平的上升，这与CelOCE的活性和作用模式一致(扩展数据图9)。

在工业条件下，这种促进效应超过了同一母株表达来自Lentinus similis的热稳定AA9 LPMO(LsAA9A)所产生的效果(图5c，附图25–27和附表13和14)，突出了CelOCE在提升木质纤维素转化效率方面的潜力。与L. similis AA9A相比，这种增强的协同效应可能归因于CelOCE独特的外切作用机制和原位过氧化氢生成能力。值得注意的是，由母株生产的酶混合物在木质纤维素解构中的效果已相当显著，具有较高的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活性，进一步凸显了CelOCE对Trichoderma分泌蛋白组在生物质糖化中的互补作用，后者是生物技术领域的核心工具。此外，含CelOCE的酶混合物已成功在65升和300升的试点植物生物反应器中生产(附图23)，证明了其工业应用的潜力。

综上所述，这些结果表明，在工业相关条件下，CelOCE能够在体外(外源添加)和体内(与Trichoderma共表达)显著促进木质纤维素生物质的转化。这一效应主要归因于CelOCE与内切纤维素酶的协同作用。

作者简介

巴西能源与材料研究中心Clelton A. Santos为本文的第一作者，Mario T. Murakami为本文的通讯作者。

Mario T. Murakami （通讯作者）

Mario T. Murakami 是一位在微生物学领域颇有影响力的研究人员，尤其以在细菌素、抗微生物肽和微生物相互作用方面的研究而闻名。他的研究在理解某些肽和蛋白质如何用于控制细菌生长方面做出了重要贡献。

翻译：荀佳妮，中国农科院基因组所，生物信息学硕士在读

审核：朱志豪，广东医科大学，基因组所联合博士后

终审：刘永鑫，中国农科院基因组所，研究员/博导

排版：杨海飞，青岛农业大学，基因组所联培硕士在读

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来源：微生物组