摘要：你是否曾有过这样的奇思妙想：如果能像拨动开关一样，精准操控我们体内的基因，那该有多么神奇？这曾经只是科幻小说中的情节，但令人振奋的是，科技的飞速发展正逐渐将梦想照进现实。3月31日基因治疗领域迎来了一项里程碑式的突破（《Nature Biotechnology

引言

你是否曾有过这样的奇思妙想：如果能像拨动开关一样，精准操控我们体内的基因，那该有多么神奇？这曾经只是科幻小说中的情节，但令人振奋的是，科技的飞速发展正逐渐将梦想照进现实。3月31日基因治疗领域迎来了一项里程碑式的突破（《Nature Biotechnology》的研究报道“Engineering a photoactivatable A-to-I RNA base editor for gene therapy in vivo”），它将科幻变为可能——一种全新的光激活RNA碱基编辑器 (Photoactivatable RNA Adenosine Base Editor, 简称PA-rABE)横空出世！这项创新如同为基因编辑工具配备了“智能遥控器”，只需一束温柔的光，便能精确启动RNA的编辑程序，实现对基因表达前所未有的精准、可逆且时空特异性的调控。

长久以来，基因治疗被誉为攻克遗传疾病、癌症等顽疾的 “终极武器”，其巨大潜力毋庸置疑。然而，如何实现对基因表达的精细化、安全化控制，一直是横亘在研究人员面前的一道难题。传统基因疗法，尤其是依赖化学诱导的系统，虽然能在一定程度上调控基因，却如同“隔靴搔痒”，难以实现纳米级的精准操作。化学诱导剂的扩散性和代谢残留，更像是一把“双刃剑”，在调控基因的同时，也可能带来难以预料的副作用，为治疗之路蒙上阴影。

正是在这样的背景下，PA-rABE应运而生。PA-rABE巧妙地借用“光”的力量，摒弃了化学诱导剂的种种弊端，实现了RNA编辑技术的华丽升级。它不仅拥有“激光制导”般的精准靶向能力，更具备“随心所欲”的可逆调控特性。只需一束光，PA-rABE便能立即启动RNA编辑，一旦撤去光照，编辑进程便戛然而止，真正实现了“召之即来，挥之即去”的完美控制。更令人惊喜的是，实验数据证明，PA-rABE在展现惊人编辑效率的同时，还能将脱靶效应降至最低，这无疑为基因治疗的安全性筑起了一道坚实的屏障。

这项突破性技术的问世，不仅为基因治疗开辟了一条崭新的道路，更宣告着光控基因编辑时代的正式到来。

告别传统疗法，RNA编辑迎来“光”时代！

基因疗法，作为一种极具潜力的疾病治疗方式，近年来在遗传疾病、癌症等多种疾病的治疗中展现出令人瞩目的前景。然而，目前的基因疗法技术，特别是外源基因表达的调控，仍然面临着一些挑战。传统的化学诱导系统，虽然可以对外源基因的表达进行调控，但其局限性也显而易见：小分子诱导剂的快速扩散和长期代谢，不仅难以实现高时空分辨率的精准控制，还可能引发副作用，尤其是在体内应用和治疗应用中，这些副作用更是不容忽视。

与DNA序列的永久性改变不同，RNA靶向方法为实现精确调控目标蛋白水平，以及开启严格控制的基因治疗的惊人途径提供了可能性。为了克服传统化学诱导系统的局限性，研究人员一直在探索更为精准、安全的调控策略。而光诱导RNA碱基编辑器的出现，无疑为我们打开了一扇全新的大门。与化学诱导系统相比，光诱导系统拥有卓越的时空精确性。此前的光激活A-to-I RNA碱基编辑器，虽然取得了一些进展，但它们依赖于光笼生物分子(photo-caged biomolecules)，这可能会带来诸如直接DNA损伤和紫外光暴露引起的光细胞毒性等风险。此外，这些系统还使用了大量化学修饰的反义寡核苷酸，在体内应用中面临着基因编码的挑战，限制了其持久性。

而PA-rABE技术，不仅避免了传统化学诱导系统的弊端，更在编辑效率、特异性和安全性方面实现了显著提升，为基因治疗开辟了全新的“光明”前景。

“指哪打哪”的RNA编辑工具：PA-rABE是如何炼成的？

PA-rABE的核心设计理念，是利用微型化的失活Cas13蛋白 (mini dCas13X) 和分裂的ADAR2去氨酶 (split ADAR2 deaminase)，并巧妙地结合了Magnets系统。Magnets系统由正磁铁 (pMag) 和负磁铁 (nMag) 组成，它们在蓝光照射下会发生二聚化，就像“磁铁”一样相互吸引。研究人员将ADAR2去氨酶分成两个无催化活性的片段——N端片段 (Q316-A468) 和 C端片段 (D469-T700)，分别与pMag和nMag-dCas13融合。

示意图（Credit:Nature Biotechnology）

这样一来，在没有蓝光照射的情况下，分裂的ADAR2去氨酶片段无法“合体”，PA-rABE处于“关闭”状态，不进行RNA编辑。而当给予蓝光照射后，pMag和nMag“手牵手”，将分裂的ADAR2去氨酶片段重新组装成具有功能的酶，PA-rABE瞬间被“激活”！此时，在crRNA (CRISPR RNA) 的引导下，PA-rABE精准地靶向目标RNA，并催化腺嘌呤 (A) 到 肌苷 (I) 的碱基转换，从而实现RNA的精准编辑。肌苷在生物化学上被识别为鸟嘌呤 (G)，因此A-to-I编辑实际上导致了功能上的A-to-G转换。

为了验证PA-rABE的RNA编辑效率，研究团队构建了一个高斯荧光素酶 (Gaussia luciferase, Gluc) 报告基因。这个基因包含一个琥珀密码子 (TAG)，导致Gluc蛋白翻译提前终止。只有当Gluc W160X转录本被成功编辑，UAG被转换为UIG，才能恢复Gluc的正常翻译，产生荧光信号。

研究人员首先比较了基于不同dCas13蛋白 (dCas13b, dCas13d, dCas13X, mini dCas13X) 的PA-rABE系统的活性。荧光素酶检测结果显示，mini dCas13X-ADAR2ddc-nMag 和 pMag-ADAR2ddN 的组合在HEK293T细胞中表现出最高的报告基因活性。 接着，研究人员又评估了11对具有不同分裂位点的ADAR2dd片段修复Gluc W160X的能力。结果发现，分裂位点在 E466/P467 的片段对显示出最高的光诱导激活 (2.9倍)。为了进一步降低ADAR2dd自发重组的可能性，研究人员使用了分裂萤火虫荧光素酶检测方法，结果表明，E466/P467位点的分裂诱导的自发重组水平最低。综合考虑激活效率和背景活性，研究团队最终选择了 Q316-E466 (N端片段) 和 P467-T700 (C端片段) 的ADAR2dd片段，用于PA-rABE的构建。

PA-rABE：高效、精准、可逆的RNA编辑“瑞士军刀”！

为了进一步优化PA-rABE的性能，研究团队对PA-rABE的结构配置进行了深入研究。他们测试了分裂的ADAR2dd片段、Magnets和mini dCas13X之间的相对方向，共测试了八种不同的配置组合。令人惊喜的是，nMag-ADAR2ddc 与 mini dCas13X-ADAR2ddN-pMag 的组合，展现出最强的光诱导荧光素酶活性，活性提高了5.1倍！

连接蛋白的柔性连接肽对于融合蛋白的功能至关重要。研究人员测试了九种不同的柔性或刚性连接肽，发现L2 (GSGGGGS) 连接肽产生了最低的背景和最高的诱导比率。 进一步优化L2连接肽的长度，L2-4 (GSGGGG) 变体成为最佳选择，诱导倍数高达19.2倍！ 为了进一步提高编辑效率，研究人员探索了先前研究中鉴定的ADAR2dd突变体。E488Q/Q421R双突变体比E488Q单突变体更有效 1.2倍。

此外，研究人员还发现，在crRNA的两侧加入双直接重复序列 (dual DRs)，可以将荧光素酶活性提高三倍！因此，双DRs被选为后续实验的guide RNA设计。 研究团队还评估了Magnets系统的不同变体，发现 nMagH 变体与 mini dCas13X-ADARddN-pMag 组合，产生了最高的诱导倍数 (47.2倍)，同时背景活性最低。 为了测试核定位信号 (NLS) 或核输出信号 (NES) 对PA-rABE系统性能的影响，研究人员将NLS或NES融合到mini dCas13X蛋白的N端或C端。结果发现，NLS融合到mini dCas13X的两个末端，PA-rABE的光诱导荧光素酶活性最高。

与传统的RNA编辑系统 (mxABE, REPAIRv2, REPAIRx) 相比，PA-rABE对Gluc W160X和mCherry W98X报告基因靶点都显示出卓越的编辑活性。更重要的是，与最近报道的padCas13编辑器相比，PA-rABE在光照下的编辑效率和诱导比率更高。值得注意的是，在crRNA存在的情况下，转染PA-rABEN 或 PA-rABEC 载体的细胞中未检测到荧光素酶报告基因活性，而转染padCas13编辑器 (具有完整ADAR2dd) 构建体的细胞则诱导了相当大的背景报告基因活性。当padCas13编辑器中的ADAR2dd被替换为无活性的ADAR2dd-E396A变体或截短的ADAR2dd时，背景活性消失，这表明padCas13编辑器较高的背景活性主要是由于完整的ADAR2dd引起。

这些数据充分证明，经过多轮优化后的PA-rABE系统，在编辑效率、诱导倍数和背景活性控制方面都达到了非常优秀的水平，堪称RNA编辑领域的“瑞士军刀”。

神奇的光控开关：PA-rABE如何“点亮”基因治疗？

为了更深入地了解PA-rABE的工作特性，研究团队对其在体外细胞中的编辑活性进行了全面表征。他们发现，crRNA的长度和A-C错配在RNA-crRNA双链体中的位置，对RNA编辑效率有显著影响。PA-rABE的最佳crRNA长度为50-60 nt，而将A-C错配置于20-30区域可获得高编辑效率。PA-rABE的编辑效率与转染质粒的总量呈正相关。

研究人员还评估了PA-rABE在Gluc报告基因变体中所有16种5'-NAN (N = A 或 C 或 G 或 U) 三联密码子中的靶向灵活性。下一代测序 (NGS) 结果表明，PA-rABE能够编辑几乎所有motif，效率各异，其中UAN是最优选的，GAN是最不优选的，这与已知的ADAR偏好一致。 鉴于mini dCas13X可以处理其自身的CRISPR阵列，研究人员设计了靶向mCherry W98X和zsGreen W93X的crRNA作为CRISPR阵列。流式细胞术分析表明，使用CRISPR阵列同时靶向两个转录本的效率与单个crRNA相当，表明PA-rABE适用于多靶点编辑。

PA-rABE对光照非常敏感，即使在极弱的光诱导 (0.01 mW cm⁻²) 下，荧光素酶报告基因也能被高度激活。随着光照时间的延长，荧光素酶活性的恢复增加，而光照 (0.25 mW cm⁻²) 甚至在长时间光照下也不影响细胞增殖和活力。更令人惊喜的是，当撤去光刺激后，PA-rABE介导的RNA编辑会逐渐恢复到静息状态，表明PA-rABE系统具有良好的可逆性和重复刺激响应能力。

为了评估PA-rABE的空间特异性，研究人员使用3D打印的掩模覆盖培养皿，从下方用蓝光照射细胞。结果显示，mCherry W98X报告基因的表达在与掩模精确匹配的区域成功恢复，证实PA-rABE能够实现高空间分辨率的RNA碱基编辑。

从细胞到动物模型：PA-rABE的强大“疗效”验证！

为了验证PA-rABE在纠正致病突变方面的潜力，研究人员选择了来自ClinVar数据库的致病性G>A突变，并将其构建到疾病相关的报告基因中。NGS分析显示，在蓝光照射下，PA-rABE能够有效编辑所有九个靶点，编辑率在12%到42%之间。值得注意的是，PA-rABE能够在一个不利的GAG背景下实现有效的编辑率 (NF1报告基因中为12%校正，USH2A报告基因中为13%校正)。研究人员进一步分析了PA-rABE在三个高编辑效率的致病性报告基因 (COL3A1, SH3TC2 和 SMN1) 中的旁观者效应。结果表明，PA-rABE在crRNA配对dsRNA区域的10-nt窗口内诱导了轻微的旁观者编辑 (靶上与旁观者比率为4-7倍)，在没有光照的情况下，在所有三个位点几乎没有观察到旁观者编辑。

在人类基因突变数据库 (HGMD) 中收集的致病性提前终止密码子 (PTCs) 中，TAA终止密码子尤其难以通过传统方法绕过，因为它需要连续两个腺苷的转换。PA-rABE能够有效转换含有部分杜氏肌营养不良症 (DMD) cDNA序列的报告基因中的TAA终止密码子。最佳活性在靶腺苷嵌入双鼓起A•C错配中时观察到。进一步优化crRNA，DMD-A21设计产生了最高的AA-to-GG转换率 (20%)。将这种crRNA设计策略应用于其他四个具有TAA PTC的致病性突变，观察到平均编辑率为35.2%。这些结果表明，PA-rABE可以使用定制的crRNA有效地将单个或连续的双腺苷转换为肌苷，为包括UAA PTC相关疾病在内的遗传疾病提供了一种有希望的治疗方法。

接下来，研究人员评估了PA-rABE有效编辑内源基因的能力。NGS分析表明，在十个内源性转录本中，PA-rABE超越了mxABE和REPAIRv2，中位编辑率高达38.5%，而mxABE为20.4%，REPAIRv2为23.7%。值得注意的是，PA-rABE有效地编辑了MALAT1，一种细胞核定位的非编码RNA，在光照下编辑率高达39.5%。这些结果表明，PA-rABE有潜力在细胞质和细胞核定位的RNA中进行有效编辑。 与其他基于ADAR的RNA碱基编辑器类似，PA-rABE也在编辑窗口内显示出旁观者编辑。为了最大限度地减少旁观者编辑，研究人员应用了先前报道的策略，包括使用高保真ADAR2dd突变体 (E488Q/T375G)、掺入G错配和删除crRNA中与不需要的腺苷相对的尿苷。所有策略都减少了旁观者编辑，但只有删除与旁观者脱靶腺苷相对的尿苷才能保持靶A-to-I转换的编辑效率。

为了评估PA-rABE的转录组范围内的特异性，研究人员将其脱靶效应与padCas13编辑器和mxABE进行了比较。全转录组RNA测序显示，mxABE系统在非靶向组中显示出268个脱靶编辑，在存在KRAS靶向crRNA的情况下显示出342个脱靶编辑。PA-rABE诱导的脱靶编辑水平与mxABE相当，光照-PA-rABEKras组中观察到304个脱靶编辑，黑暗-PA-rABEKRAS组中观察到272个脱靶编辑，PA-rABE-NT组中观察到267个脱靶编辑。而padCas13编辑器诱导了严重的脱靶事件，与PA-rABE相比，光照下观察到的脱靶活性增加了40倍以上。差异转录组分析表明，PA-rABE对转录组谱没有影响，无论crRNA靶点如何。这表明PA-rABE系统中mini dCas13X与靶RNA的结合并没有实质性影响靶RNA的功能，因为在包括KRAS及其下游靶点的mRNA水平在内的上述两组中均未观察到转录组差异。总的来说，PA-rABE在转录组水平上显示出高活性和高保真度。

为了评估PA-rABE的体内功能，研究人员通过尾静脉注射 (HTV) 将编码PA-rABE和含有提前终止密码子 (Fluc W426X) 的萤火虫荧光素酶报告基因的质粒递送到野生型小鼠的肝脏组织中。在蓝光照射下，PA-rABE靶向Fluc W426X RNA导致报告基因活性显著增加66倍！总荧光素酶强度比padCas13编辑器高17.5倍。

接下来，研究人员设计了靶向内源性CTNNB1的苏氨酸 (T) 41密码子的crRNA，该位点的磷酸化会促进β-catenin的降解。PA-rABE诱导Wnt信号通路显著增加115.6倍，总荧光素酶强度比padCas13编辑器高7.4倍。为了验证PA-rABE在活体动物中的能力，研究人员将表达靶向小鼠CTNNB1的PA-rABE的minicircle载体，以及TCF/LEF荧光素酶报告基因，通过HTV注射递送到野生型小鼠肝脏。蓝光照射后，发光生物显像在注射后3天进行测量。光照小鼠的荧光信号显著增加，与黑暗处理的小鼠相比，β-catenin刺激的荧光素酶活性激活增加了186倍！

最后，研究团队将PA-rABE应用于血友病B (Hemophilia B, HB) 的治疗。他们构建了靶向凝血因子IX (hF9) Padua变体 的PA-rABE，这种变体包含一个提前终止密码子 (hF9 Padua-W118X)。在F9383STOP小鼠模型中，光照组小鼠的活化部分凝血活酶时间 (aPTT) 显著缩短至30.6秒，与野生型小鼠相当，表明PA-rABE有效地恢复了HB小鼠的凝血功能。ELISA结果显示，光照组小鼠肝脏组织中hF9 Padua蛋白水平显著高于黑暗组。免疫荧光染色进一步证实了肝组织中hF9 Padua的表达，光照组小鼠hF9蛋白恢复显著增加，且hFIX信号主要集中在肝组织下边缘，表明其表达具有光依赖性。

这些体内实验数据充分证明了PA-rABE在基因治疗方面的巨大潜力。

光控RNA编辑技术将如何改变生命科学和医学？

这项研究成功开发出的PA-rABE技术，为RNA编辑领域带来了革命性的突破。它不仅实现了对RNA编辑的精准光控，更在编辑效率、特异性和安全性方面实现了全面提升。PA-rABE的出现，为基因治疗开辟了全新的方向，也为生命科学研究提供了强大的工具。

未来，PA-rABE技术有望在以下几个方面发挥重要作用：

更精准的基因治疗：PA-rABE的光控特性，使其能够实现对疾病基因表达的时空精准调控，最大限度地提高治疗效果，并降低脱靶风险和副作用。例如，在癌症治疗中，PA-rABE可以被用来精准激活肿瘤微环境中的CAR-T细胞，从而提高CAR-T细胞疗法的安全性和有效性。

更灵活的疾病模型：PA-rABE技术可以被用来构建更精细、更可控的疾病模型，帮助研究人员更深入地研究疾病的发生发展机制，加速新药研发进程。

更广泛的应用场景：PA-rABE技术不仅可以用于基因治疗，还可以应用于细胞工程、合成生物学等多个领域，为生命科学研究和生物技术发展注入新的活力。

当然，PA-rABE技术仍处于早期研究阶段，未来还需要进行更多的研究和优化，才能最终走向临床应用。但我们有理由相信，随着技术的不断进步，光控RNA编辑技术必将会在生命科学和医学领域发挥越来越重要的作用，为人类健康带来更多福祉。

参考文献

Li, H., Qiu, Y., Song, B. et al. Engineering a photoactivatable A-to-I RNA base editor for gene therapy in vivo. Nat Biotechnol (2025). https://doi.org/10.1038/s41587-025-02610-2

责编|探索君

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