摘要：研究概述：肝癌已成为全球癌症相关死亡的第三大原因。早期分析表明，肿瘤遗传学和肿瘤微环境特征可能影响ICI反应。在肝癌患者中，已知Wnt/β-catenin通路的异质性ICI反应率在临床前模型和患者中观察到。在肝癌中，根据地理区域的不同，大约26-37%的患者携

影响因子：9.5

研究概述：肝癌已成为全球癌症相关死亡的第三大原因。早期分析表明，肿瘤遗传学和肿瘤微环境特征可能影响ICI反应。在肝癌患者中，已知Wnt/β-catenin通路的异质性ICI反应率在临床前模型和患者中观察到。在肝癌中，根据地理区域的不同，大约26-37%的患者携带CTNNB1基因的突变，该基因编码β-catenin。在成人中，β-catenin在正常生理条件下（在没有Wnt配体的情况下）被磷酸化、泛素化，并由蛋白酶体降解机制降解。然而，突变使得β-catenin无法被磷酸化或泛素化，导致其稳定并在核内转移，作为转录共因子与TCF/LEF家族成员一起激活目标基因表达。因此，识别β-catenin激活的患者可能在肝癌中具有直接的预后和治疗意义。因此，为了将这种治疗组合转化为临床实践，需要动物模型来重现特定遗传驱动因素驱动的复杂分子生物学，而不是随机的癌基因组合。具体研究如下：

研究结果：

HCC 相关的NRF2和MET双基因评分

作者之前工作已经确定了β-catenin与NRF2激活之间以及β-catenin与MET激活之间的协同作用（这在患者HCC里占9-12%）。在本研究，作者研究NRF2和MET共同激活是否在HCC的发病机制中起协同作用，以及这是否可以在体内建模以研究这样一个独特亚群的肝脏肿瘤生物学。首先，为了确定是否有患者肿瘤亚群在NRF2和MET激活方面存在重叠，作者从肝细胞癌（LIHC）患者的癌症基因组图谱（TCGA）中提取了数据集。（总共374个HCC病例，其中包括50个相邻正常组织的病例）。为了定义一个NRF2活跃（以下简称为NRF2-high）的患者群体，作者应用了层次聚类分析，使用先前发表的28个基因NRF2激活基因signature，将病例分为4个不同的簇。此外，为了定义一个MET活跃（以下简称为MET-high）的患者群体，作者应用了层次聚类分析，使用先前发表的KAPOSI_LIVER_CANCER_MET_UP 18-基因集。结果表明： 54个HCC患者（14.4%在TCGA中显示出NRF2-high和MET-high基因签名的重叠，并且4.8%有CTNNB1突变（图a）。作者把他们与50个正常组织病例相比，得出了5,238个差异表达基因（DEGs）。对5,238个DEGs进行识别出254个显著富集的通路（图b）。因此，NRF2和MET的同时激活在HCC患者中一个显著的亚群中是显而易见的。鉴于β-catenin与NRF2以及β-catenin与MET之间的协同作用，作者假设NRF2/MET-high患者亚群中可能也存在CTNNB1突变。随后作者识别出35例（9.4%）CTNNB1突变/NRF2-high重叠病例和41例（10.9%）CTNNB1突变/MET-high重叠病例。此外，在54例TCGA-LIHC NRF2-high/MET-high患者中，有18名患者，即所有HCC病例的4.8%，存在CTNNB1突变（图a）。有趣的是，这18名患者中，有12名患者（67%）在外显子3上有突变，5名患者（28%）在外显子8上有突变，1名患者在外显子7上有突变（图d）。此外，在12名外显子3突变患者中，8名（67%）属于D32-S37亚群，2名（17%）患者属于S45亚群，2名（17%）患者属于T41亚群（图d）。此外，鉴于作者识别出许多表现出高β-catenin活性的患者（大多数在D32-S37亚群中），作者查询了这些患者的肿瘤是否表现出更具侵略性的表型。结果发现，与所有其他CTNNB1突变患者（n=80）相比，18例CTNNB1突变/NRF2/MET-high患者确实趋向于更差的总生存期（OS）（p=0.104）（图e）。然而，当比较CTNNB1突变/NRF2/MET-high（n=18）与CTNNB1野生型/NRF2/MET-high患者（n=36）时，OS没有差异，这表明在NRF2/MET-high患者中，CTNNB1突变并不影响生存。

HCC 相关的NRF2和MET双基因评分

作者之前研究表明单独的癌基因诱导（无论是GOF突变型CTNNB1、GOF突变型NFE2L2还是hMET），都不会在小鼠中诱导肝细胞癌（HCC）。因此为了在体内模拟，作者通过尾静脉注射（HDTVI）和转座子/转座酶，强制表达S45Y-CTNNB1 ± G31A-NFE2L2 ± hMET于6周龄的FVB雄性小鼠中（图a）。注射S45YCTNNB1 + G31A-NFE2L2 + hMET（b-N-M）的小鼠在HDTVI后5周显示出比其他β-catenin驱动模型和注射G31A-NFE2L2 + hMET（N-M）的小鼠更早的发病和死亡（图b）。这种侵略性表型与临床队列的生存分析相呼应（上图e）。在5周时间点，作者观察到肝脏有明显的HCC，并且与野生型FVB的肝重（LW）/体重（BW）比率4-5%相比，有显著增加至15%（p

携带突变型GOF β-catenin的小鼠肿瘤在转录上与未激活β-catenin的肿瘤不同

接下来，作者对来自突变型β-catenin模型（b-N-M模型，n = 3；b-M模型，n = 3；b-N模型，n = 3）和非β-catenin模型（N-M模型，n = 3）的肿瘤进行了转录分析，并与正常小鼠肝脏进行比较，以识别每个模型中富集的肿瘤途径（图a）。对15个样本进行的主成分分析显示，野生型与所有肿瘤模型（b-N-M、b-M、b-N和N-M）有明显的聚类区分。小鼠肝脏肿瘤在b-N-M和b-N之间有相似的聚类，而b-M和N-M之间也有相似的聚类（图b）。为了识别每个携带肿瘤模型的潜在基因，作者通过将野生型肝脏与每个肿瘤模型（b-N-M、b-M、b-N和N-M）进行比较来确定差异表达基因（DGEs）。随后作者对这些差异表达基因的通路分析确定了芳香烃受体信号和NRF2介导的氧化应激反应等途径的激活（图c）。与野生型相比，DGE分析在b-M中识别出1,016个上调基因和527个下调基因，以及在b-N中识别出2,405个上调基因和1,950个下调基因。此外，与野生型相比，b-M和b-N（图d-e）的通路分析也识别出了先前描述的相关途径。对这些差异表达基因的通路分析确定了包括NRF2介导的氧化应激反应、外源性物质代谢、肝纤维化信号和谷胱甘肽氧化还原反应等途径的激活（图f）。

突变型GOF β-catenin模型更具有突变型β-catenin基因特征

接下来，作者尝试推导出一个特定于HCC中β-catenin活性的基因评分。首先，作者进行了以下模型比较的DGE分析：N-M与b-N-M、N-M与b-M以及N-M与b-N，以允许将每个β-catenin突变模型与β-catenin野生型模型进行比较，然后重叠共同的DEGs，最终识别共同上调（95个基因）（图a-b）和下调基因（53个基因）（图c-d）。对95个上调基因进行富集分析识别出谷氨酰胺生物合成、Wnt/β-catenin信号、谷氨酸能受体信号和视黄醇/视黄酸生物合成等途径的富集（图e）。对53个下调基因进行分析识别出S100家族信号通路、无粒中性粒细胞粘附和游走、以及吞噬体形成等途径的富集（图f）。

MBGS识别CTNNB1突变患者

在上文提及的95个富集基因中，有85个在TCGA-LIHC队列中与人类同源基因一一对应。作者对这些85个人类基因进行了DGE分析，比较CTNNB1野生型和CTNNB1突变案例，识别出13个在CTNNB1突变HCC案例中上调的差异表达基因：AXIN2、GLUL、LGR5、NKD1、NOTUM、RHBG、SBSPON、SLC13A3、SLC1A2、SP5、TCF7、TEDDM1和TNFRSF19，这些构成了作者的13基因MBGS（图a）。这些基因也在比较正常和CTNNB1突变型与野生型表达的热图上展示（图b）。作者进一步比较了正常组织、CTNNB1野生型和CTNNB1突变型组织中个别基因的表达；观察到SLC1A2在正常组织中表达较高；而TEDDM1和SBSPON仅在一部分CTNNB1突变HCC案例中表达（图c）。因此，作者制定了一个简化的10基因MBGS，仅包括AXIN2、GLUL、LGR5、NKD1、NOTUM、RHBG、SLC13A3、SP5、TCF7和TNFRSF19。

接下来，作者想要确定13基因和10基因MBGS是否具有预测TCGA-LIHC患者CTNNB1突变的能力。于是评估了正常组织、CTNNB1野生型和CTNNB1突变型组织中13基因（图a）和10基因（图b）MBGS的平均表达量。在TCGA-LIHC中，13基因和10基因MBGS具有预测CTNNB1突变案例的能力，AUC分别为0.91和0.90，13基因MBGS的敏感性和特异性分别为0.857和0.877（图c）。作者还在另一个包含398例法国HCC病例的队列中测试25例正常（n = 31）、CTNNB1野生型（n = 280）和CTNNB1突变（n = 118）案例中13基因和10基因MBGS的表达，并显示出在CTNNB1突变案例中签名的显著富集（图d-e）。在法国队列中，13基因和10基因MBGS具有预测CTNNB1突变案例的能力，AUC分别为0.95和0.94（图f）。此外，根据Boyault G1-G6亚群状态分层的患者组中MBGS的平均表达显示在G5/G6亚群中富集，因为这个亚群富含CTNNB1突变和活跃的肿瘤（图g-h）。

MBGS预测肝癌患者中的免疫治疗相关疗效

作者还评估了MBGS表达水平是否反映了IMbrave150队列中CTNNB1突变患者观察到的结果，在该队列中，与CTNNB1野生型患者相比，CTNNB1突变患者接受阿特珠单抗/贝伐珠单抗（atezo/bev）治疗的效果较少。在IMbrave150队列中，13基因和10基因MBGS相互关联，并且在CTNNB1突变患者中富集（图a-c）。有趣的是，在接受atezo/bev治疗的患者中，MBGS的表达并未预测总生存期（OS）或无进展生存期（PFS）（图d-e）。此外，在MBGS表达较高的患者中，在索拉非尼治疗组中观察到OS或PFS的改善，这解释了在比较高表达与低表达MBGS队列时，atezo/bev与索拉非尼治疗效果的差异。具体来说，MBGS表达较低的患者在接受atezo/bev治疗时，在OS（p = 0.0329）和PFS（p = 0.0293）方面显示出与索拉非尼相比的临床改善（图b），这可能归因于索拉非尼在MBGS低表达患者中的治疗效果较少。作者进一步使用mRECIST标准对每个治疗组的完全/部分反应（CR/PR）、稳定疾病（SD）和进展疾病（PD）以及MBGS表达进行了分层。在索拉非尼治疗组中，较高的MBGS表达与CR/PR或SD相关，而在atezo/bev治疗组中则没有相关性（图f），说明CTNNB1活性的患者从索拉非尼治疗中获得显著的临床益处，但与对联合ICI的原发性抗性无关。

遗传变异分析数据

最后，鉴于先前有报道称CTNNB1突变患者具有免疫排斥表型，但并不一定与ICI耐药性相关，作者决定使用空间转录组数据集将MBGS（以及其他分子亚群签名）映射到组织切片上，以观察被认定为MBGS高表达的肿瘤中的免疫轮廓。作者整合了两个先前发表的HCC空间转录组数据集。首先，作者为Boyault、Chiang和Hoshida分子亚分类方案的每个10X Visium斑点计算了标准化的模块得分表达值。有趣的是，在幻灯片中，Boyault G5/G6签名突出显示了与MBGS高表达的肿瘤结节（图a）。此外，G1/G2亚群的结节与G3或G5/G6或MBGS高表达结节是互斥的，这表明Boyault分类特定于肿瘤内在信号。然而，Chiang分子亚分类显示MBGS高表达的肿瘤与Chiang_CTNNB1和Chiang_IFN亚群的肿瘤重叠得很好，肿瘤结节和组织基质区域都表现出Chiang_IFN亚群的高表达。作者将MBGS与先前报道的Wnt-CTNNB1签名进行了比较，与其他突变型Wnt分类相比MBGS中的基因在检测肿瘤结节时总体表达更高（图b）。最后，作者将Sia等人的‘免疫类别’基因签名33的空间表达映射到不同的组织切片上，观察到MBGS高表达的肿瘤在肿瘤实质内被免疫排斥，但在某些情况下可能表现出炎症性基质（图c），这可能促成了在一部分CTNNB1突变患者中报告的‘免疫样’亚群，这些患者可能对ICIs有反应。

研究总结：

本研究成功开发并验证了一个13基因突变β-catenin基因签名（MBGS），用于识别肝细胞癌（HCC）患者中CTNNB1基因突变。通过分析β-catenin突变和野生型HCC小鼠模型的转录组数据，研究者们发现了一组与β-catenin活性相关的基因，这些基因在多个HCC患者队列中显示出与CTNNB1突变状态的强烈相关性。MBGS不仅能够以高敏感性和特异性预测CTNNB1突变状态，而且在法国的另一个HCC患者队列中也显示出了良好的预测能力。此外，研究还发现MBGS高表达的肿瘤在肿瘤实质内呈现免疫排斥现象，但在某些情况下可能在基质中表现出炎症反应，这可能与CTNNB1突变患者对免疫检查点抑制剂（ICIs）的反应性有关。研究结果强调了MBGS在HCC患者分子分型中的潜在应用价值，尤其是在精准医疗和伴随诊断方面。MBGS的发现为HCC的预后评估、治疗选择和疗效监测提供了新的分子工具。此外，MBGS与已知的分子亚群签名相比，显示出优越或相当的性能，这进一步证实了MBGS在HCC分子分类中的重要性。研究还探讨了MBGS与多种免疫和分子亚型之间的关系，发现MBGS与特定的免疫微环境特征相关，这可能影响HCC患者对特定治疗的反应。综上所述，本研究虽然也是基于生信得到的风险模型，但是与既往的生信文章不同在于，作者基于基因小鼠组间对比得到的差异基因，使得实验上升了一个层次。

来源：老齐讲科学