摘要：本研究构建了一种合成微生物群落（SynComs），该群落能够显著提升榨广椒的品质，并有效缩短其发酵时间。本研究深入探讨了SynComs发挥功能的潜在机制，揭示了其如何通过调节微生物代谢途径来优化榨广椒的发酵过程。这一发现为传统发酵食品的改良升级提供了宝贵的参考

原位合成微生物群落通过提高原生微生物的发酵能力来改善榨广椒的品质

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研究论文

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● DOI:

● 2025年3月16日，华中农业大学赵述淼等在iMetaOmics在线发表了题为“

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● 第一作者：沈红叶

● 通讯作者：赵述淼（shumiaozhao@mail.hzau.edu.cn）

● 合作作者：杜传宇、姜舒、董卫卫、李金山、胡咏梅、彭楠

● 主要单位：华中农业大学生命科学技术学院、湖北师范大学生科院

亮 点

● 构建了一个适用于传统发酵食品——榨广椒的原生合成微生物群落，它可以提高榨广椒产品的风味物质含量、缩短榨广椒的发酵时间，并验证了合成微生物群落的发酵效果全面优于单一类型的接种和未接种的对照组;

● 合成微生物群落显著改变了榨广椒发酵系统中真菌群落构成和演替模式，但对细菌群落演替影响较小;

● 合成微生物群落可能通过增强群落中其他原生微生物对风味物质产生的贡献从而全面提高榨广椒的品质。

摘 要

发酵食品是全球饮食的重要组成部分，占全球食物摄入量的三分之一。传统的发酵食品通常依赖于自然发酵，存在安全风险。构建适合发酵食品的合成微生物群落（SynComs）是解决这些问题的关键策略。在这里，我们以榨广椒为研究模型，设计并构建了由2种细菌和3种真菌组成的SynComs。利用高通量测序技术，研究了发酵过程中微生物群落的动态变化，并评估了SynComs对发酵过程的影响。SynComs缩短了约15天的发酵时间，提高了风味产量（乳酸乙酯和乙酸乙酯的产量均为8%），大大改善了榨广椒的品质。同时，SynComs改变了真菌群落的演替，使Pichia成为整个发酵过程中的优势微生物，真菌群落的演替模式也更接近于0模型。宏基因组注释结果显示显著功能基因发生了变化，尤其是糖苷水解酶家族。SynComs可能增强了本地微生物产风味化合物的能力，提高了其他群落微生物对风味生产的贡献。我们提出推论：SynComs通过提高原生微生物的发酵能力来改善发酵食品的品质。

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全文解读

引 言

目前，世界正面临着营养和粮食安全方面不断升级的挑战。发酵食品在全球食品供应中至关重要，它们可以丰富膳食多样性、改善肠道微生态并促进人类健康。发酵是一种历史悠久的食品保存和加工方法，其中最早的面包类产品可追溯到约公元前14600年。发酵过程中微生物群落的活性决定了发酵食品的安全性、营养价值和产量。许多发酵食品在制作过程中都需要引入特定的微生物。例如，中国白酒的制作过程中会添加酒曲，许多日本发酵食品则使用麴作为发酵剂，而酸乳酒的制作则需要添加乳酸菌。然而，许多传统发酵食品并不引入特定的发酵菌群，而是完全依赖环境微生物和生产者引入的微生物，这在东南亚和非洲欠发达地区很常见。随着工业化生产的发展，自然发酵的传统食品遇到了食品安全和产品质量不稳定等问题。接种有益微生物促进发酵是解决这些问题的一个可行办法。

合成微生物群落（SynComs）是在合成生物学和微生物菌种工程学的交叉点上发展起来的，它为发酵食品的生产带来了新的机遇。合SynComs不仅扩大了工程化微生物食品的范围，还能生产安全健康的发酵食品和饲料。尽管SynComs已在多个领域得到应用，但其在发酵食品中的有效性筛选和验证方法尚未得到广泛认可。目前的大多数研究都未能彻底调查SynComs如何影响发酵微生态系统及其影响程度。此外，验证SynComs中单个菌株效果的实验设计也不够充分。关于SynComs在发酵食品生产中的构建、应用和验证研究，以及其作用和机制的研究仍然有限。通过比较SynComs接种与单一菌株接种的效果，我们可以阐明SynComs如何相互作用及其对微生态环境的影响。这将为优化发酵食品生产过程、提高产品质量和安全性提供重要的理论基础和实际指导。了解发酵过程中微生物群落结构和功能的动态变化是控制基础发酵系统的基础。发酵食品中的微生物来源和种类多种多样，主要分为三大类：细菌、丝状真菌和酵母菌。这些微生物在发酵过程中发挥着不同的作用，形成了一个复杂的微生物群落。细菌中以为主乳酸杆菌、醋酸菌杆菌、芽孢和梭状芽孢杆菌。这些细菌通过分解淀粉和产生有机酸来发酵食品，赋予其独特的口感和营养价值。尤其是乳酸杆菌，它不仅能分解淀粉，还能抑制致病菌的生长，对确保发酵食品的安全性至关重要。乳酸杆菌，酵母（如酿酒酵母）能从有机酸中产生酯、醇和其他调味物质。这些物质为发酵食品带来了独特的风味和营养价值，增强了其吸引力。丝状真菌，如毛霉霉、根和毛霉菌，主要产生各种胞外酶。这些酶包括蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、纤维素酶和多酚酶，对发酵食品的质量和口感有重大影响。然而，由于发酵食品中微生物的多样性，接种和强化所有类型的微生物并不可行。因此，构建能显著提高发酵质量的SynComs至关重要。这不仅能提高发酵产品的质量和安全性，还能促进发酵食品生产的工业化和自动化。

基于宏基因组学的方法已成功用于表征各种生态环境中微生物的组成和功能。然而，宏基因组学在发酵食品中的应用相对较少。目前的研究主要侧重于发酵过程中微生物相对丰度的变化以及环境因素，但缺乏对微生物功能基因变化的研究。宏基因组学不仅能提供更准确的物种鉴定，还能揭示微生物群落的潜在功能基因，因此是分析生物群落结构和功能动态变化规律的有效手段。这种方法有助于深入了解发酵微生物群落的演替变化。

在此，我们模拟了实验室生产榨广椒的过程，并收集了发酵过程中的样品进行多种检测和分析，旨在解决以下问题：(1)能否利用图S1A所示的分析和计算方法获得SynComs，并通过扩增子测序和各种调味物质的检测（如图S1B所示）从多批榨广椒中分离目标菌？(2)菌株如何单独发挥作用（如图S1C所示）？接种单菌对整个发酵过程中微生物组的分类和功能有何影响（即SynComs的影响，如图S1D所示）？单菌组别是否优于SynComs组以及各菌株单独作用的组别？(3)接种SynComs对榨广椒发酵过程中群落中的其他微生物有何影响？对微生物群落演替有何影响（如图S1E所示）？此外，本研究还旨在提出，SynComs可通过改变其他微生物的功能来改善整个微生物系统的性能。本研究全面探讨了SynComs在发酵食品中的构建和功能评价，提高了榨广椒制品的质量，并为控制和改善其他发酵食品或更简单的微生物环境提供了新的研究视角。

结 果

SynComs的构建和菌株分离

为了选择适合榨广椒发酵的微生物群（SynComs），我们广泛研究了榨广椒发酵过程中（0、3、10、30和45天）微生物群的动态变化、风味化合物的演变以及理化因素的变化。相关分析揭示，有两种关键微生物群对榨广椒品质产生显著影响：一是负责产生挥发性风味化合物的风味组，二是负责产生游离氨基酸的氨基酸组（如图1A所示）。此外，我们还利用直接相关分析和微生物网络分析，确定了榨广椒发酵系统中的强节点微生物，这些微生物包括重合群（即表S1中的菌株1B和C）、风味群、共生群、氨基酸群以及主要菌群（含）。这些微生物对发酵过程至关重要，因为它们的稳定性和活性在很大程度上决定了发酵质量。斯皮尔曼相关分析进一步表明，细菌和真菌之间的协同作用在榨广椒发酵过程中非常重要（如图1D所示）。这些微生物与多种风味物质和理化因素之间存在强烈的相关性，这表明在构建SynComs时，应同时考虑细菌和真菌的组成。

基于这些分析，我们定义了风味组、氨基酸组、共生组和主要组（平均相对丰度>0.1%）。通过进一步交叉比对这些组别，我们确定了具有统计学意义的SynCom1（如图1E所示）。为确保食品安全，我们决定从榨广椒中就地筛选出本地微生物，以形成SynComs。为实现这一目标，我们对榨广椒产品进行了三轮筛选，分离出了许多原生生物。值得注意的是，虽然在氨基酸酵母菌群中没有获得可培养的菌株，但相对丰度较高的产香酵母菌，如Kazachstania（45天时相对丰度为0.8%）和Kluyveromyces（相对丰度为0.09%），在三个批次中均被分离出来，数量级介于106之间。酵母菌一直被认为是发酵食品中重要的产香微生，因此我们将酵母菌确定为榨广椒SynComs的另一种关键成分。

结合具有统计学意义的SynCom1和菌株分离结果，我们确定了本研究中的核心菌属：乳酸菌、酿酒酵母菌、假丝酵母属、魏氏菌属和毕赤酵母属。这些菌属将组成我们研究的SynComs。

图1. 筛选功能微生物菌属

(A) 主要微生物属的相关热图、挥发性风味物质和游离氨基酸。(B) 主要微生物之间的相关热图。(C) 主要微生物之间的网络分析。(D) 细菌和真菌群落与主要的理化因子的mental相关性分析。(E) 各个功能微生物组交集的venn图。

SynComs中单独菌株的发酵效果

在进行SynComs发酵之前，本研究调查了单个菌株接种的作用，以验证接种单个菌株是否足以改善的榨广椒品质。微生物群落的活动常常引起各种理化因子的变化，这些理化因子能够反映微生物群落的代谢活动和功能状态。

通过检测发酵过程中水分含量、酸度和pH值的变化，我们发现六组样品的变化模式基本一致（如图2A所示）。然而，在还原糖含量的变化方面，接种Pichi-1和Sac-1的两组样品在发酵初期（第0天）的还原糖含量明显低于其他四组。尽管各组还原糖含量的变化趋势相似，即从0天到3天逐渐下降至最低点，然后从3天到10天略有回升，之后继续波动并下降，但接种Pichi-1和Sac-1的两组样品的初始还原糖含量仍然较低。至于有机酸，作为发酵食品中的重要调味物质，乳酸、乙酸和乙醇在所有六组样品中的含量变化模式相似。值得注意的是，在发酵结束时，这些物质的含量在六组样品之间并没有显著差异。另外，接种Wess-1、Pichi-1和Sac-1的三组样品在发酵初期（第0天）的还原糖含量较低，这可能表明这些菌株在更有效地利用糖分进行发酵。

利用气相色谱-质谱（GC-MS）技术，我们在发酵结束时的榨广椒产品中鉴定出了140多种挥发性代谢物。随后的主成分分析（PCA）显示，WESS组、LAB组和PICHI组的组内差异较小，表明这三个组的发酵产品在挥发性风味物质含量方面具有较高的相似性，产品质量相对稳定（如图2B所示）。从这140种挥发性风味物质中，我们筛选出了30多种具有宜人香气的可食用风味物质。这些风味物质根据其化学成分被分为五类：酸、醇、醛、酯和酚。其中，乳酸乙酯和乙酸乙酯作为发酵食品中的主要成分，受到了特别关注（如图2C所示）。乳酸乙酯在LAB组和WESS组中含量较高，而乙酸乙酯在CK组中含量较低。己酸在SAC组和CAN组中含量略低。此外，芳樟醇和橙花醇是具有花香的天然风味化合物，在所有六个组别中的含量相似，但在WESS和PICHI组别中的含量高于其他组别。α-松油醇是橙花醇的一种成分，在植物精油中常见，其含量在所有六个组别中也相似。值得注意的是，藏红花中提供独特气味和香气的主要活性物质藏红花醛在PICHI组中含量最高，而在CK和CAN组中含量较低。

总体而言，单一菌株接种可以提高某些挥发性风味物质的产量，但主要理化因子的变化趋势并不随单个菌株接种而改变。因此，我们可以得出结论：单一菌株接种并不能全面提高榨广椒主要风味物质的产量。这一发现为我们进一步理解和优化榨广椒的发酵过程提供了有价值的见解。

图2. SynComs名单中菌株单独接种菌株的影响

(A) 在单独接种实验中，发酵过程中主要理化因素的变化。(B)挥发性风味物质的主成分分析结果。(C)各组主要挥发性风味物质相对含量的热图，星号表示食物中常见的风味物质。 (D)各组主要有机酸、乙醇和葡萄糖含量的变化。

接种SynComs对榨广椒的影响

在本研究中，我们深入比较了对照组（CK组）与接种SynComs组（Lpscw组）在发酵过程中主要理化因素、风味物质、微生物群落组成和功能基因的动态变化。在五个关键时间点（第0、3、10、30和45天），我们对这些指标进行了细致的监测和量化分析（图3A-D）。结果显示，Lpscw组在pH值的变化上呈现出更快的下降趋势，而在含水量和酸度方面，两组表现出相似的变化趋势。然而，值得注意的是，在发酵初期（第0-3天），Lpscw组的糖含量明显低于CK组（图3A），这可能意味着Lpscw组中的微生物群落更高效地利用了糖分。

在乳酸、乙酸和乙醇的含量变化上，两组均呈现出特定的趋势。乳酸含量从0天到30天持续上升，在第30天达到峰值；乙酸含量则从10天到30天不断累积；而乙醇含量在整个发酵过程中保持稳定。特别地，在发酵初期，Lpscw组的葡萄糖含量就明显低于CK组，且在整个发酵过程中，CK组的葡萄糖含量波动较大，而Lpscw组的葡萄糖含量则相对稳定（图3B）。

GC-MS分析进一步揭示了两组之间的差异。结果显示，CK组和Lpscw组之间的差异大于组内差异（R = 0.6353，p = 0.001），表明不同发酵时间的样品可以得到有效区分（图3C）。在发酵初期（0-10天），两组的风味物质相似度较高；但随着发酵时间的延长至30-45天，Lpscw组和CK组之间的风味物质差异逐渐增大。具体来说，大多数挥发性化合物的含量随着发酵时间的延长而增加，但少数化合物的含量却有所下降（图4D）。特别是某些特定风味物质，如芳樟醇、橙花醇、香叶醇、乳酸乙酯和乙酸乙酯的含量，在发酵后期（30-45天）Lpscw组明显高于CK组。此外，Lpscw组在发酵后期产生的己酸（一种有异味的物质）少于CK组，这表明Lpscw组在产生更多调味物质和更少异味物质方面具有显著优势。

综上所述，Lpscw组在发酵过程的各个方面，包括理化因素、风味物质产生以及可能的微生物群落组成和功能基因表达上，都表现出相对于CK组的优越性。这些发现为我们进一步理解和优化利用SynComs进行榨广椒发酵提供了重要依据。

图3. SynComs的接种效果

(A) 在不同的接种实验中，发酵过程中主要理化因素的变化。(B) 各组主要有机酸、乙醇和葡萄糖含量的变化。(C) 挥发性风味物质的 PCA 分析。(D) 各组主要挥发性风味物质相对含量的热图，星号表示食物中常见的风味物质。

本研究借助宏基因组测序技术，深入探讨了榨广椒发酵过程中Lpscw组和CK组微生物群落的演替规律。研究结果显示，两组在微生物组成和演替趋势上展现出一定的相似性（图4A），主要优势菌属包括Escherichia、Acinetobacter、Salmonella和Corynebacterium。值得注意的是，由于Lpscw组额外接种了微生物群落，我们观察到其中Lacticaseibacillus的平均丰度略高于CK组，分别为2.5%和2.33%。尽管如此，尽管Lpscw组加入了魏氏菌，但其在细菌群落中的丰度并未跻身前50位。在真菌属层面（图4B），Lpscw组和CK组的主要优势真菌属相似，涵盖Pichia、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Alternaria、Aspergillus和Candida等。然而，两组在真菌属群落演替的变化上却存在显著差异。CK组在发酵前期（0-3天）以Pichia和Zygosaccharomyces为主，但随着发酵的推进，它们逐渐被Saccharomyces所取代。相反，在Lpscw组中，Pichia在整个发酵过程中始终占据主导地位。此外，Lpscw组中Candida的丰度高达8.5%，而在CK组中则仅为0.05%。

线性判别分析效应大小（LEfSe）分析进一步揭示了两组之间存在显著差异的物种（生物标记物）（图S2）。在细菌方面，Lpscw组的生物标记物相对丰度普遍较高，这可能与额外接种的乳酸杆菌有关。而在真菌生物标记物中，Pichia和Saccharomycetale最为常见，其中Pichia_kudriavevii是Lpscw组中额外添加的菌株之一，因此其丰度自然较高。但值得注意的是，除了Pichia_kudriavevii外，Lpscw组中其他所有真菌生物标志物的丰度也普遍较高，这表明SynComs的接种显著改变了榨广椒发酵过程中的真菌群落演替。

综上所述，本研究发现接种SynComs对榨广椒发酵过程中真菌群落的演替具有显著影响，但对细菌群落组成的影响相对较小。这些发现为我们深入理解和优化榨广椒发酵过程中的微生物群落结构提供了重要依据。

图4. 属级微生物群落的组成和动态

真菌前20位，细菌前位25，数字代表重复每个区域的样本。(A)细菌真菌群落的动态。(B)四个地点的真菌群落动态。

接种SynComs改变了群落的功能基因组成和演替模式

本研究结合了京都基因组百科全书（KEGG）和碳水化合物活性酶（CAZy）数据库的功能注释，对榨广椒发酵过程中Lpscw组和CK组的基因功能进行了深入分析。KEGG数据库的注释结果显示，碳水化合物、氨基酸和脂类的代谢在微生物群落功能中占主导地位，而其他五条主要途径所占比例均低于5%（图S3A和B）。这表明，在榨广椒发酵过程中，微生物群落主要参与这些基本生物分子的代谢。特别是碳水化合物代谢，作为微生物群落最主要的功能，对于榨广椒的发酵特性具有重要影响。CAZy数据库的注释结果进一步揭示了与碳水化合物降解相关的酶类分布。糖苷转移酶（GTs）家族是最主要的CAZymes，占比超过60%，其次是糖苷水解酶（GHs），约占12%。糖苷转移酶负责生物合成糖苷键，而糖苷水解酶则负责水解糖苷键。在Lpscw和CK组中，与碳水化合物降解相关的前10种主要酶包括GT1、GH28、GH38等（图S3B）。其中，GT1是发酵微生物群落中含量最高的酶，但随着发酵的进行，其含量逐渐减少，表明发酵后期对糖基转移酶的需求降低。

基于LEfSe分析，我们比较了Lpscw组和CK组在KEGG和CAZy数据库中的功能基因注释结果（图S4）。在KEGG中，CK组在翻译、核糖体、丙酸代谢和甜菜碱生物合成等功能方面表现出较高的活性，而Lpscw组则在淀粉、蔗糖、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢方面更为活跃。这些差异突出了发酵过程的复杂性，并表明两组微生物群落在功能基因上存在差异。在CAZy数据库注释结果中，Lpscw组主要涉及糖基转移酶（GT）和糖苷水解酶（GH）家族。这些变异可能会影响碳水化合物的代谢和产物的多样性。特别是，接种特有的生物标记物在榨广椒发酵过程中明显改变了CAZyme的功能基因，这进一步证实了SynComs对发酵过程的影响。

综上所述，本研究通过KEGG和CAZy数据库的功能注释，揭示了榨广椒发酵过程中Lpscw组和CK组在微生物群落功能上的差异。这些发现为我们深入理解和优化榨广椒发酵过程中的微生物群落结构和功能提供了重要依据。特别是，SynComs的接种明显改变了CAZyme的功能基因，这可能会对碳水化合物的代谢和代谢产物的多样性产生深远影响。

接种SynComs改变了群落的演替模式

现代生态学理论在解释微生物群落形成时，强调了决定性因素与随机因素的共同作用。其中，决定性过程基于生态位理论，强调环境压力和物种间的选择与竞争；而随机过程则遵循中性理论，主要受扩散和随机生死事件的影响。

在本研究中，我们利用Raup-Crick指数（RC指数）来评估微生物群落的相似性及其背后的驱动因素。对于细菌群落，Lpscw组和CK组的RC指数均接近-1，这表明两组细菌群落之间的高度相似性主要是由确定性过程（特别是生态位选择）所驱动的。然而，尽管两组的RC指数相似，但驱动这些相似性的具体因素可能存在差异（图5A）。在真菌群落演替方面，CK组的RC指数同样接近-1，这暗示真菌群落的可变性和相似性低于随机模型的预期，主要受确定性过程的影响。然而，在Lpscw组中，真菌RC指数呈现出不同的模式，部分样本的RC指数接近0，这表明这些样本的相似性或不相似性与中性模型预期一致，可能受到随机过程的影响。特别地，Lpscw组第45天的样本与其他样本存在显著差异（图5B），这进一步支持了随机过程在真菌群落演替中的潜在作用。

非计量多维尺度（NMDS）分析为我们提供了关于微生物群落动态变化的直观证据。对于细菌群落，早期和中期的榨广椒样本聚集在一起，表明这些时期的群落结构存在确定性过程的影响。而晚期群落则表现出分散性，这暗示了随机过程在群落结构变化中的贡献（图5C和D）。总体而言，如NMDS图所示，真菌群落表现出强烈的环境选择和确定性过滤。应力值低于0.2证实了NMDS分析的可信性，进一步支持了真菌群落主要受确定性过程影响的结论。然而，值得注意的是，在特定条件下（如Lpscw组的真菌群落演替后期），随机过程也可能对群落结构产生显著影响。

图5. Lpsc与CK群落的Raup-Crick指数计算分析

(A) 各组间细菌群落的Raup-Crick指数分布；(B) 各组间真菌群落的 Raup-Crick 指数分布；(C) 各组间细菌群落基于Raup-Crick差异指数的 NMDS 排序；(D) 各组间真菌群落基于 Raup-Crick 差异指数的NMDS排序。*表示p p

微生物群落在榨广椒发酵过程中对挥发性风味物质的产生起着至关重要的作用。本研究通过对比CK组和Lpscw组中的微生物群落与挥发性风味物质之间的关系，揭示了不同微生物群落对榨广椒风味形成的不同影响。

在CK组中，毕赤菌、酵母菌和念珠菌与榨广椒的主要风味物质显著正相关。特别是，Pichia（毕赤属）与芳樟醇、橙花醇、α-松油醇、香叶醇和4-乙基-2-甲氧基苯等挥发性化合物显著正相关，这些化合物通常赋予食品特定的香气特征。酵母菌则与大多数挥发性风味物质和主要有机酸（如SAFRANAL、乙酸己酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸和乙酸）呈显著正相关，表明酵母菌在榨广椒风味形成中扮演着重要角色。念珠菌同样与几乎所有主要挥发性香料物质和有机酸显著相关，尤其是与乙酸，进一步强调了CK组中这些真菌对风味物质的贡献。

然而，在Lpscw组中，微生物群落与挥发性风味物质之间的关系呈现出不同的模式。酵母菌、念珠菌、曲霉菌和微球菌与主要的挥发性风味物质呈正相关，但值得注意的是，Pichia并没有显示出任何显著的正相关。相反，白色念珠菌（一种念珠菌）、曲霉和微球菌与大多数挥发性风味物质呈正相关。在相对丰度排名前十的真菌中，有几个属具有产生挥发性风味物质的能力，这与CK组形成了鲜明对比。在CK组中，大多数菌属似乎抑制了挥发性风味物质的产生，而在Lpscw组中，则有更多的菌属促进了这些风味物质的生成。

图6. Lpscw和CK组与主要挥发性风味物质和主要有机酸的相关性结果

展示相对丰度排名前10位的真菌风y与主要风味物质的关系(*表示 pp p

讨 论

传统发酵食品的生产手工模式确实带来了安全和质量一致性等方面的挑战，而工业化生产虽然可能简化发酵微生物系统，但也可能影响产品的独特风味。为了应对这些挑战，人工接种SynComs（合成微生物群落）成为了一种有潜力的解决方案。

在我们的研究中，我们采用了先进的方法来构建和优化用于榨广椒工业生产的SynComs。我们根据王石磊等人提出的白酒酿造系统核心微生物群落的鉴定方法，将挥发性风味物质含量的变化与微生物群落数据相关联，通过交叉分析和微生物相关网络分析，确定了榨广椒发酵过程中的“核心微生物群落”。

实验结果表明，我们筛选出的“核心微生物群落”在榨广椒发酵中是可靠的。在重复实验中，这些微生物菌属在两年多的发酵过程中始终是产味微生物菌属，这与我们之前的研究结果一致。此外，通过单菌株接种实验，我们发现虽然一些单一菌株接种组在一定程度上提高了某些风味物质的含量，但它们对风味产生的总体影响并没有明显优于未接种的CK组。这一发现进一步强调了使用SynComs接种进行榨广椒发酵的必要性。

接种SynComs对榨广椒品质的提升作用显著，不仅体现在理化指标、有机酸及挥发性风味物质的含量变化上，还深刻影响了微生物群落的演替和功能基因组成。首先，从理化指标和有机酸的变化来看，Lpscw组（接种SynComs组）相较于CK组（对照组）表现出更稳定的组内差异，且有机酸含量峰值一般出现在第30天，比CK组提前了15天。这表明接种SynComs不仅缩短了榨广椒的发酵时间，还使得理化指标和有机酸产量的变化更加稳定。其次，在挥发性风味物质含量方面，Lpscw组的乙酸乙酯和乳酸乙酯含量比CK组增加了8%，且在第30天达到最大值，而CK组则在第45天达到最大值。这一发现进一步证实了SynComs在缩短发酵风味产品生产周期、提高挥发性感官物质含量方面的优势。

此外，接种SynComs还改变了榨广椒发酵过程中GH（糖苷水解酶）家族的丰度，这可能影响了微生物群落代谢碳水化合物的能力，从而改变了产生的代谢物类型，对风味合成产生了积极影响。同时，SynComs的接种也影响了真核微生物的组成，使得Lpscw组的真菌群落演替模式与CK组有所不同。具体来说，Lpscw组的RC指数在某些时间点接近0，表明其相似（或不相似）程度更接近中性模型的预测值，意味着环境生态过滤器对Lpscw组的限制比CK组要小。

值得注意的是，在Lpscw组中，并未显示出Pichia（毕赤菌属）与主要风味化合物之间的强烈相关性，而是相对丰度排名前十的其他真菌对主要风味特征有积极的贡献。这表明接种SynComs的作用不仅限于产生风味物质，还可能通过影响群落中其他微生物的功能，从而改善整个微生物系统的群落结构和功能。

综上所述，接种SynComs可以全面提高榨广椒的品质，包括缩短发酵时间、提高理化指标和风味物质的稳定性及含量、改变功能基因组成和微生物群落结构等。这些发现为传统发酵食品的工业化生产提供了新的思路和方法，有助于推动传统发酵食品的现代化和国际化发展。未来，可以进一步深入研究SynComs的组成、结构和功能，以及其与发酵食品品质之间的关联机制，为优化发酵工艺和提高产品品质提供理论依据和技术支持

结 论

在本研究中，我们筛选并建立了与榨广椒发酵相关的SynComs，并在随后的单菌种和混合菌种发酵实验中验证了其接种效果。我们通过宏基因组测序深入研究了发酵过程中微生物群落的组成和功能基因的变化。同时，利用气相色谱-质谱技术，我们监测了发酵过程中挥发性风味化合物的动态变化。SynComs显著改善了发酵过程，使榨广椒的发酵时间缩短了约15天，同时主要风味物质（如乳酸乙酯和乙酸乙酯）的产量均提高了8%，这为工业化规模生产榨广椒提供了重要指导。同时，SynComs对榨广椒发酵系统中的微生物群落产生了显著影响。具体而言，它改变了微生物群落的组成和演替模式，特别是使真菌群落发生了显著变化，其中Pichia成为了整个发酵过程中的优势微生物。此外，功能基因组成也发生了变化，特别是GH家族的丰度有所增加。这些发现凸显了SynComs在改良传统天然发酵食品中的重要作用，为今后提高发酵食品的安全性和风味稳定性提供了一种有效方法。这项研究进一步表明，SynComs能够通过调节其他微生物物种的作用来改善整个微生物群落的功能。为了验证这一推论，我们将继续研究其他微生物系统，这将是未来研究的一个重要方向。

方 法

实验设计和样本收集

榨广椒是一种传统的发酵食品，由玉米（或大米）和新鲜辣椒制成，在受控的半开放环境中生产。为发酵实验准备了足够的种子培养物。我们对筛选得到的菌株进行了活化和两轮培养，以确认其纯度。在实验室中，我们模拟了榨广椒的生产过程，将干榨广椒捣碎制成榨广椒酱，与玉米粉按4:6的比例混合均匀，然后装入厌氧呼吸袋进行厌氧发酵。榨广椒生产过程见图S1A。

每批样品在0、3、10、30和45天时分别采集，每个时间点采集三个平行样品，并保留至少五个重复样品以备后续分析之用。我们从所有发酵样品中随机抽取部分样品，混合均匀后进行取样分析。收集部分样品进行理化性质分析，其余样品放入零下80摄氏度的超低温冰箱中低温保存，以备后续实验之用。榨广椒样品信息见表S4。

理化因子检测

风味物质分析

对于其他芳香化合物的检测，我们采用了顶空固相微萃取和气相色谱-质谱（HS-SPME GC-MS）技术，参考Sun的研究方法。具体步骤如下：取8毫升上述过滤后的上清液，放入装有3.0克氯化钠的20毫升自动进样瓶中，得到饱和氯化钠溶液。同时，加入内标物质2-辛醇和2-乙基己醇。然后，使用自动顶空取样系统（MPS2XL）在50°C下萃取45分钟。萃取完成后，将SPME纤维在250°C下插入进样口5分钟，使化合物解吸。解吸后的化合物通过Agilent HP-5色谱柱（30m×0.25 mm，ID，Decoaryl；0.25 μm）和DB-FFAP色谱柱（60m×0.25 mm，Bonded Fluorinated-Fused Silica Apolar；0.25 μm）进行分离，并通过GC-MS（Agilent 7890B GC）进行分析。

宏基因组DNA提取

我们使用OMEGA Mag-Bind Soil DNA Extraction Kit（M5635-02，Omega Bio-Tek，Norcross，GA，USA）按照制造商的说明提取了微生物基因组DNA。提取后的总样本DNA在进一步评估前保存在-20°C。为了测定提取DNA的数量和质量，我们使用了Qubit™ 4荧光仪（Invitrogen，美国），配合Qubit™ dsDNA HS检测试剂盒（检测管：Q32856；试剂盒：Q33231）进行检测。同时，我们还通过琼脂糖凝胶电泳对DNA进行了质量评估。

经过处理的微生物DNA被用于构建Illumina TruSeq Nano DNA LT文库。我们为每个文库制备了插入长度为400bp的元基因组枪式测序文库，并采用了PE150策略在美国Illumina平台上进行测序。测序工作由派森诺公司完成。

宏基因组学分析

为了获得用于进一步分析的质量过滤读数，我们对原始测序读数进行了以下处理步骤：首先，我们使用Cutadapt（v1.2.1）去除了测序读数中的测序适配器，以确保读数的准确性。其次，利用Fastp中的滑动窗口算法，我们对低质量读数进行了修剪，从而得到了经过质量过滤的读数。随后，我们使用Kraken2对每个样本的读数进行了对照RefSeq衍生数据库基因组学的分类。该数据库涵盖了古生菌、细菌、病毒、真菌、原生动物、元类动物以及植物病毒的基因组，有助于对元测序读数进行精确分类。在分类过程中，分配给元古宙或不符合要求的读数会被移除，以确保下游分析的准确性。

接下来，我们使用Megahit（v1.1.2）并设置大类预设参数，对每个样本的读数进行了组装，生成了等位基因。为了确保等位基因的质量，我们只选择了长度超过300bp的等位基因进行后续分析。然后，我们使用mmseqs2（Steinegger和Söding, 2017）以"easy-linclust"模式将等位基因进行了集中和聚类。在聚类过程中，我们设置了序列同一性阈值为0.95，覆盖率阈值为较短等位基因残基的90%，以获得非冗余的等位基因。为了获得非冗余的最低共同祖先分类，我们使用了mmseqs2数据库对聚类后的等位基因进行了分类。同时，我们还以"分类"模式将等位基因与NCBI-nt数据库进行了比对，以进一步了解等位基因的信息。在预测基因方面，我们采用了mmseqs2中的MetaGeneMark，并使用"easy-cluster"模式对所有样本的CDS序列进行了聚类。聚类过程中，我们设置了蛋白质序列同一性阈值为0.90，覆盖率阈值为较短等位基因的90%，以获得高质量的基因预测结果。为了评估这些基因的丰度，我们使用Salmon将每个样本的读数映射到了预测的基因序列上，并计算了每百万映射读数的每千碱基拷贝数（CPM）来归一化元基因组中的丰度值。最后，为了了解非冗余基因的功能，我们使用了mmseqs2以"搜索"模式对照KEGG、EggNOG和CAZy等数据库进行了注释。同时，我们还通过EggNOG-mapper（v2）获得了EggNOG和GO注释，并使用map2slim（http://www.metacpan.org）进行了GO注释的简化。此外，我们还通过KOBAS获得了KO注释，以全面了解基因的功能信息。

统计分析

数据处理和可视化工作主要借助R软件包tidyverse（版本2.0.0）来完成。在统计检验方面，我们使用了stats（版本4.2.1）软件包中的函数。具体来说，T检验用于比较两组数据的均值差异，Kruskal-Wallis秩和检验则用于多组非参数数据的比较，而Wilcoxon秩和检验（通过函数wilcox.test实现）则用于两组非参数数据的比较。为了评估样本的多样性，我们计算了阿尔法多样性指数。这些指数包括香农指数、Pielou均匀度指数、观测物种指数和Faith's PD指数，它们都是通过vegan（版本2.7）软件包中的多样性函数来计算的。这些指数为我们提供了关于样本内物种丰富度和均匀度的有价值信息。在Beta多样性分析方面，我们使用vegan（版本2.7）软件包计算了一系列指标，以衡量样本间的差异。这些指标包括Jaccard相异性、Bray-Curtis相异性和其他可能的相异性指标（如PCA和ADONIS检验中涉及的指标），它们有助于我们了解采样地点和样本间的变化关系。特别地，我们使用了rda函数进行了主成分分析（PCA），并借助ADONIS检验来评估与采样地点相关的变化。在数据可视化方面，我们主要依赖于ggplot2（版本3.5.1）软件包。为了直观地展示数据，我们使用了complexheatmap（版本2.16.0）和pheatmap（版本1.0.12）软件包来绘制热图。此外，我们还使用了Chase等人提供的自定义函数来计算Raup-Crick相似度指数，以进一步分析样本间的相似性。

代码和数据可用性

所有扩增子测序原始数据已存入NCBI序列读取存档数据库，生物项目编号为PRJNA782862(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA782862/)和PRJNA784134(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA784134/)。所有宏基因组测序的原始数据已存入美国国家生物信息局（NCBI）序列读取档案数据库，生物项目编号为PRJNA1131906(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1131906/)。本研究使用的脚本和数据可在https://github.com/hyShen-hzau/Synthetic-Microbial-Communities-in-iMateOmics.git上找到。补充材料（图、表、图解摘要、幻灯片、视频、中文翻译版本和更新材料）可通过在线 DOI 或 iMeta Science 查阅（http://www.imeta.science/imetaomics/）。

引文格式：

Hongye Shen, Chuanyu Du, Shu Jiang, Weiwei Dong, Jinshan Li, Yongmei Hu, Nan Peng, et al. 2025. “Native Synthetic Microbial Communities Enhance zha-chili by Boosting the Fermentation Capacity of Indigenous Microorganisms”. iMetaOmics2: e70009. https://doi.org/10.1002/imo2.70009.

作者简介

沈红叶（第一作者）

● 华中农业大学生命科学技术学院在读博士研究生。

● 研究方向为应用微生物领域和发酵工程，以第一作者在Microbiome、Food Bioscience和iMateOmics等期刊发表SCI论文。

赵述淼（通讯作者）

● 华中农业大学教授，博士生导师。

● 现任华中农业大学生科院发酵工程室主任，International Journal of Food Microbiology期刊编委。主要致力于微生物种质资源收集、酿造微生物、饲用微生态制剂和生物饲料开发等研究工作。近年来在Microbiome、Bioresource Technology、Food Research Intenational、Food Bioscience等期刊发表研究论文20余篇，主编教材1部，参编教材2部，获国家发明专利授权16项，省部级鉴定成果2项，湖北省科技进步一等奖1项。

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期刊简介

“iMeta” 是由威立、宏科学和本领域数千名华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等前沿交叉学科。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括中英双语图文、双语视频、可重复分析、图片打磨、60万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊！相继被Google Scholar、PubMed、SCIE、ESI、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.8，中科院分区生物学1区Top，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，是定位IF>10的高水平综合期刊，欢迎投稿！

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来源：微生物组