摘要：鱼鳞病，这种皮肤会出现异常鳞屑的疾病，远比我们想象中复杂。它不仅有多种类型，还涉及到众多基因的作用。2025年2月，来自南方医科大学的林志淼和王慧君团队在1区11分Top期刊British Journal of Dermatology上发表了题为《Varian

鱼鳞病，这种皮肤会出现异常鳞屑的疾病，远比我们想象中复杂。它不仅有多种类型，还涉及到众多基因的作用。2025年2月，来自南方医科大学的林志淼和王慧君团队在1区11分Top期刊British Journal of Dermatology上发表了题为《Variants in KLF4 affecting residue Asp441 cause an autosomal dominant syndromic ichthyosis》的研究性文章。

研究人员在四名常染色体显性遗传的综合征性鱼鳞病的散发性患者中，发现了两种不同的KLF4 Asp441杂合错义突变。进一步利用皮肤类器官研究发现KLF4 Asp441突变通过抑制KLF4表达影响角质形成细胞分化相关基因及WNT信号通路基因转录，最终导致皮肤角化、毛发生长和多个器官系统发育异常。本研究有望为鱼鳞病的诊断和治疗提供新的分子靶点。让我们一起解读这篇文章，看看皮肤类器官培养技术又在鱼鳞病研究中发挥了怎样的重要作用！

文章介绍

#1

研究背景

Background

鱼鳞病是一组临床异质性的皮肤疾病，特点是皮肤鳞屑异常。先天性鱼鳞病由致病性基因突变引起，可以进一步分为综合征性和非综合征性两种类型。与非综合征性鱼鳞病（症状仅限于皮肤）不同，综合征性鱼鳞病表现为系统性症状，涉及皮肤以外的多个器官。迄今为止，已有超过30个基因与各种综合征性鱼鳞病相关联。

转录因子Krüppel样因子4（KLF4）在皮肤中高表达，促进终末表皮分化和表皮屏障形成。已有研究发现KLF4与常染色体显性遗传的掌跖角化病和进行性对称性红斑角化症有关。纯合KLF4缺失的小鼠在出生后不久就因皮肤屏障严重受损而死亡。2022年，Malovitski等人发现KLF4的功能丧失突变会导致常染色体显性掌跖角化病（PPK），该突变的KLF4使靶基因DSG1的转录下调，导致桥粒芯蛋白1表达降低。此外，团队此前发现了一例由KLF4的新突变引起的进行性对称性红斑角化病（PSEK）病例。这些发现表明致病性KLF4突变可导致多种疾病。

#2

研究思路

Methods

作者采用全外显子组测序（WES）结合Sanger测序来确定4名综合征性鱼鳞病患者的基因缺陷。采用蛋白质结构建模和双荧光素酶报告基因检测来研究致病突变对KLF4的影响。利用含有致病突变的人类胚胎干细胞H9系（hESC-H9）来源的皮肤类器官进行机制探索。RNA-seq分析差异表达基因，qRT-PCR和免疫荧光进一步检测皮肤类器官和患者皮肤样本中KLF4靶基因的表达。通过以上实验明确了KLF4 Asp441突变通过下调KLK7和WNT10A表达导致多器官发育异常。

#3

研究结果

Results

1. 患者临床特点

作者研究了来自4个不同家庭的4名散发性患者，这些家庭具有不同的种族背景（表1）。所有患者的父母非近亲，且其家庭成员健康。

表1

临床表现（图1a-e）包括：

（1）先天性鱼鳞病，表现为弥漫性（病例1-3）或散在性（病例4）皮肤增厚和角化过度，有或没有色素沉着，通常伴有毛囊角化症；

（2）弥漫性掌跖角化症，扩展至手脚背部，伴有关节垫、硬皮指（指肢硬化）和手指挛缩，影响手部活动；

（3）口周角化过度和红斑，涉及口唇（角裂性唇炎）、眼周、鼻孔、肛门和生殖器周围的皮肤；

（4）肥厚性指甲营养不良；

（5）少毛症，表现为稀疏且脆弱的头发，有或没有局部瘢痕性脱发；

（6）其他皮肤外表现，包括感音神经性耳聋和下肢淋巴水肿（表1）。

这些涉及皮肤、指甲和头发的特征通常在出生时或出生后不久表现出来，并持续进展，其中一些表现（如感音神经性耳聋和其他皮肤外表现）在儿童早期逐渐出现。病例1前臂损害的组织病理学检查显示，表层真皮中有层状角化过度和血管周围的炎症细胞浸润（图1f）。

图1a

图1b-d（从上到下）

图1e（上）和f（下）

2. 发现患者的KLF4突变

为了研究这种表型的遗传基础，对4名患者以及病例1的健康父母进行了全外显子组测序。首先关注了病例1中的新突变，发现KLF4（NM_004235.6）中存在一个杂合突变c.1322A>G（p.Asp441Gly）。接着在病例2的测序结果中也发现了相同的突变，并通过Sanger测序确认该突变为新突变。没有在GJB2和其他与遗传性耳聋或遗传性淋巴水肿相关的基因中发现任何致病性突变。通过GeneMatcher，发现了另外两例也携带KLF4新突变。综合来看，在KLF4中鉴定出了两个杂合错义突变，即病例1、2和3中为c.1322A>G（p.Asp441Gly），病例4中为c.1323T>A（p.Asp441Glu）（图2a）。这两个错义突变都影响位于KLF4的锌指结构（ZF）2结构域中的相同残基Asp441（图2a）。这两种新发现的KLF4突变在gnomAD v.4.1.0和多个已知的公共数据库中均未出现，并且通过SIFT和MutationTaster预测工具均预测为致病性突变。受影响的残基Asp441在多个物种中高度保守（图2b）。

图2a

图2b

3. 计算机预测突变KLF4的蛋白结构变化

接下来作者通过蛋白质建模评估了这两个错义突变对KLF4蛋白结构的影响。如图2c和2d所示，受影响的残基Asp441位于C端域ZF2的α-螺旋中，且Asp441的侧链直接与Arg439和Arg445残基接触，促进了氢键的形成，从而稳定了α-螺旋的局部结构。将酸性天冬氨酸替换为高度灵活的非极性甘氨酸或较大的谷氨酸，预计会破坏与Arg439的氢键，并阻止它们适应相同的空间约束，从而影响局部结构的稳定性（图2e-f）。

图2c（上）和d（下）

图2e（上）和f（下）

4. KLF4在患者皮肤中表达降低

由于在由KLF4突变引起的常染色体显性遗传PPK和PSEK中观察到KLF4表达水平下降，作者接下来首先进行qRT-PCR检测KLF4 mRNA水平。如图3a所示，患者皮肤中的KLF4 mRNA水平显著降低。随后对患者和健康对照的皮肤切片进行了KLF4免疫荧光染色。结果显示，KLF4在对照组的表皮中呈现明显的核内表达，而在4名患者的表皮中KLF4的表达显著降低（图3b）。这些发现表明，患者携带的突变导致了KLF4表达的下调。

图3a

图3b

5. KLF4突变导致其转录活性降低

为了评估已识别的KLF4突变是否影响其转录活性，我们使用了双荧光素酶报告基因检测法。结果显示，与野生型组相比，表达p.Asp441Glu或p.Asp441Gly突变的细胞的荧光素酶活性显著降低（图3c），提示这两个突变的转录活性受到显著抑制。

图3c

6. 含有KLF4 c.1323T>A突变体的皮肤类器官表现出上皮发育缺陷

为了确定KLF4突变对皮肤发育的影响，作者构建了源自hESC-H9的皮肤类器官，以模拟KLF4突变导致的皮肤病变发生过程。首先构建了携带病例4所具有的杂合KLF4突变c.1323T>A（p.Asp441Glu）的hESC-H9细胞系（图4a）。随后从KLF4D441E/+和野生型hESC-H9细胞中分别筛选出三个单克隆细胞用于进一步诱导皮肤类器官分化。野生型皮肤类器官在分化过程中表现出典型的形态变化，并在分化约60天时，表层外胚层开始出现毛囊结构（图4b）。对野生型hESC-H9来源的皮肤类器官进行整体染色后，表皮表面可见多个KRT17阳性的毛囊（图4c）。相比之下，尽管携带c.1323T>A突变的皮肤类器官在分化初期10天内与野生型类器官形态相似，但从第20天起，KLF4D441E/+类器官的表层外胚层开始塌陷，到第30天时，100%的类器官已完全失去上皮结构（图4b-d）。即使延长培养时间，KLF4D441E/+类器官中也未观察到毛囊的形成。这些结果表明，KLF4 c.1323T>A突变可能导致上皮发育缺陷，并可能影响毛囊的正常发育。

图4a

图4b

图4c（上）和d（下）

7. KLF4突变体导致KLF4D441E/+类器官和患者皮肤病变中的KLK7和WNT10A表达下调

为了进一步揭示与上皮发育缺陷相关的分子机制，对第30天的皮肤类器官样本进行了转录组RNA-seq。由于KLF4是表皮发育的关键转录因子，重点关注了与角化相关的信号通路，并注意到许多下调的差异表达基因富集在涉及表皮发育、角化和角质形成细胞分化的生物学过程中（图5a），这表明KLF4中的c.1323T>A突变影响了皮肤发育。

图5a

接下来鉴定导致KLF4D441E/+皮肤类器官发育异常的差异表达基因。RNA-seq结果显示，在KLF4D441E/+类器官中，编码蛋白激酶和蛋白激酶抑制剂的多个基因（如KLK5、KLK7和CST6）表达下调（图5b）。这些蛋白质在表皮角化和皮肤脱屑中发挥作用。为了确定KLK5、KLK7和CST6是否是KLF4的潜在靶基因，分析了一个来自人类包皮角质形成细胞的公开KLF4染色质免疫沉淀（ChIP）测序数据集（GEO: GSM1387028），并发现KLF4结合位点位于KLK5、KLK7和CST6基因的内含子区。因此将KLK5、KLK7和CST6基因的转录起始区克隆到pGL4.23荧光素酶报告质粒中，并评估了在HEK293T细胞中转染野生型和两种不同KLF4突变后的荧光素酶活性。结果表明，所有三个基因驱动的荧光素酶活性均被野生型KLF4转染诱导，表明KLK5、KLK7和CST6基因受KLF4转录调控。然而，只有KLK7驱动的报告基因在两种KLF4突变刺激后表现出一致的表达下降（图5c）。这一结果提示，Asp441残基的突变可能仅降低KLK7基因的转录。

图5b（上）和c（下）

随后，作者使用从患者皮肤病变或健康对照中提取的mRNA进行了qRT-PCR实验。结果显示，与健康对照相比，所有患者皮肤样本中KLK7的mRNA表达水平均降低（图5d）。此外，对患者病变的皮肤切片进行了免疫荧光染色，发现KLK7蛋白的表达也减少（图5e）。这些结果表明， KLF4突变导致KLK7的表达降低。

图5d

图5e

此外，为了探索KLF4突变如何影响患者的皮肤表型，重点关注WNT信号传导，这是KLF4调控的关键发育通路。根据RNA-seq数据，在KLF4D441E/+类器官中，包括WNT5A、WNT5B、WNT10A和WNT6在内的几个WNT信号传导基因显著下调。值得注意的是，WNT10A在多种组织和器官的发育中起着至关重要的作用，包括皮肤和附属物、内耳和淋巴管。相应地，在患者的皮肤病变中检测到WNT10A表达显著降低（图5f）。

图5f

小结

本研究中，作者通过外显子测序发现了4名鱼鳞病患者的KLF4基因存在全新的错义突变，且这些患者的突变均发生在Asp441。经检测患者来源样本和KLF4突变的皮肤类器官模型发现，突变导致KLK7和WNT10A表达降低，从而影响包括皮肤等多种器官的正常发育。

参考文献

Wang Z, Liu J, Wechsberg O, et al. Variants in KLF4 affecting residue Asp441 cause an autosomal dominant syndromic ichthyosis. Br J Dermatol. Published online February 19, 2025. doi:10.1093/bjd/ljaf062

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来源：培养盒守护者