摘要：如何准确识别调节宿主代谢的微生物的代谢物的研究具有很大的挑战性。本研究鉴定和追踪了一种独特的细菌多形拟杆菌，它产生的鞘脂向结肠和肝组织转移，发现了多形拟杆菌合成的鞘脂可以改善肝脏脂质的过量积累。

如何准确识别调节宿主代谢的微生物的代谢物的研究具有很大的挑战性。本研究鉴定和追踪了一种独特的细菌多形拟杆菌，它产生的鞘脂向结肠和肝组织转移，发现了多形拟杆菌合成的鞘脂可以改善肝脏脂质的过量积累。

炔基改性脂质用于追踪微生物-宿主代谢物的转移

独特的细菌鞘脂从肠道微生物群转移到肝脏

微生物鞘脂可改善肝细胞的呼吸作用

细菌鞘磷脂的合成可减少肝脏脂质的过度积累

，多形拟杆菌，是人类肠道中最丰富的共生益生菌之一，能够根据食物来源的变化，将自身四分之一以上的基因调节到活跃状态，分解人体本身无法消化的多糖如纤维素等，在向宿主提供营养的同时也为自己和肠道中的其他细菌获得营养。

肠道微生物来源的鞘脂类化合物对宿主的代谢具有重要调节作用，与代谢疾病息息相关。然而，我们只找到了少数从微生物到宿主组织的具有生物活性的代谢物。最近，《Cell Host & Microbe 》（2023 IF 20.6/Q1）期刊上发表的一项研究通过生物正交标记策略，成功追踪到了来自肠道共生菌——多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）合成的鞘脂进入肠道和肝脏。研究发现，这些鞘脂可以缓解小鼠肝脏的脂质过度积累，还能够显著改善肝细胞在脂肪酸过载情况下的呼吸反应。这项研究不仅揭示了细菌鞘脂在调节宿主肝脏功能中的潜在作用，还为鉴定其他微生物代谢物对宿主健康的影响提供了一种新的研究方法。

肠道微生物产生的代谢物已知能够参与宿主体内生理过程的调节，从而有助于宿主的健康。尽管这些代谢物对宿主具有巨大的系统性影响，许多代谢物的鉴定和功能表征仍然比较模糊。目前，只有少数微生物来源的代谢物被发现能够转移到宿主组织，但其中许多缺乏明确的生物活性。此外，尽管已证明微生物来源的小分子能够影响肝脏功能，但需要进一步探索以提供这些代谢物直接从微生物转移到肝脏的证据。发现能转移到肝脏的微生物代谢物为代谢紊乱提供了治疗靶点，这些代谢紊乱既来自于相应的代谢物，也来自于对应微生物在体内的丰度。

生物活性鞘脂（SLs）是一类在微生物和宿主中都产生的代谢物，在哺乳动物能量代谢途径中具有明确作用，由拟杆菌属（Bacteroides）和普雷沃氏菌属（Prevotella）等主要肠道微生物合成。此外，微生物鞘脂生产已在从领鞭毛虫到植物再到哺乳动物的各种宿主-微生物共生系统中被表征。已知细菌鞘脂能够参与宿主免疫系统的调节，如调节自然杀伤T细胞和减少肠道炎症，但目前研究揭示的其相关的生物活性主要限于结肠和局部免疫的扰动。细菌鞘脂生产还可以改变肝脏中的鞘脂水平，但鞘脂合成对宿主肝脏表型的生理效应以及完整的鞘脂是否能从微生物转移到肝脏以影响宿主代谢仍不清楚。本研究基于多形拟杆菌来源的棕榈酸衍生脂质可以进入宿主组织的基本特征，鉴定了相关脂质，确定了它们是否转移到肝脏，并确定它们是否可能调节肝脏代谢表型。

本研究综合运用了化学标记、质谱分析、RNA测序、代谢组学和免疫组化等多种技术手段，系统地研究了细菌鞘脂类化合物在宿主中的代谢和功能（下图Graphical abstract）。研究人员使用炔基棕榈酸（PAA）标记多形拟杆菌新合成的鞘脂（SLs），通过荧光检测和代谢组学监测细菌SLs在宿主中的转移。在细胞水平，本研究从多形拟杆菌中分离出高丝氨酸-二氢神经酰胺（hsDHCer），处理肝细胞系HepG2，进行RNA测序分析，评估细胞内氧化磷酸化、脂肪酸代谢和糖酵解通路的变化；测量HepG2细胞的氧气消耗率（OCR），评估线粒体呼吸活性。本研究还在肝脂肪变性的小鼠模型中比较野生型多形拟杆菌（BTWT）和SPT缺陷突变体（SLMUT）的作用，分析小鼠直肠或肝脏中脂酰肉碱水平和肉碱棕榈酰基转移酶1（CPT1）的表达、脂质的积累以及转录组，以评估代谢相关表型的变化。

PAA标记的棕榈酸处理多行拟杆菌，然后喂养小鼠，检测肠和肝脏中的鞘脂变化，明确了宿主肝脏中的鞘脂来源。

为了研究细菌来源的SL向哺乳动物宿主的转移，研究人员开发了一种在体内追踪SL转移的方法，该方法用棕榈酸炔（PAA棕榈酸的替代物）的细菌培养物给小鼠口服，并使用荧光检测和比较代谢组学监测炔基修饰的脂质的转移（图1A，B）。SL的从头生物合成始于氨基酸和脂肪酰辅酶A通过丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）缩合形成3-酮鞘氨醇碱。这些3-酮鞘氨醇转化为鞘氨醇（SBs），进一步形成更复杂的SLs（图1C）。为了确定PAA衍生的代谢物，在有和没有PAA的情况下培养BTWT和SLMUT，并检测它们相应的代谢物（图1B）。通过非靶向代谢组学分析揭示了代表与含炔基脂质相关的化合物的差异代谢特征（图1D）。结果发现SLMUT中不含炔基脂质，而甘油酯类含量增加（图1D）。因为SLMUT是SPT突变的菌株，用它来确定细菌来源的SLs对肝脏脂质代谢的影响。

（A）追踪细菌鞘脂（SL）转移到宿主组织的示意图。（B）SL生物合成和棕榈酸炔（PAA）整合的示意图。PAA处理野生型多形拟杆菌（BTWT）或其SL-null突变体（SLMUT），随后化学连接Alexa Fluor-647叠氮化物和共聚焦荧光显微镜，在高分辨率质谱分析后进行非靶向代谢组学分析。（C）使用PAA合成SLs的生物合成途径。（D）用棕榈酸（PA）、PAA处理或不处理后的含炔SLs的热图。蓝色表示新的SLs。

(2) 来源于多形拟杆菌的鞘脂从肠道微生物转移到结肠和肝脏

为了确保被追踪的脂质来源于多形拟杆菌，在BTWT和SLMUT使用了PAA标记的脂质（图2A）。BTWT和SLMUT培养物在PAA存在下生长，然后口服给小鼠（BTWTPAA和SLMUTPAA）（图2B）。在每天口服BTWTPAA或SLMUTPAA培养物一周之前，将无特定病原体的小鼠置于这种无脂肪（高蔗糖）饮食中一个月（图2B）。在BTWTPAA处理和SLMUTPAA处理的小鼠的盲肠内容物中观察到相似水平的炔基标记的脂质（图2C）。与SLMUTPAA小鼠相比，在BTWTPAA小鼠的组织中检测到高得多的炔基标记的脂质（图2C），这表明细菌合成的SLs增强了代谢物向宿主组织的转移。基于点击化学的检测显示BTWTPAA衍生的代谢物转移到BTWTPAA小鼠的结肠和肝组织中（图2C）。当细菌培养物被热杀死时，没有观察到转移（图S6F），这表明对于观察到的细菌SLs转移对宿主组织的影响。

（A）用棕榈酸炔（PAA）标记多形拟杆菌代谢物以产生BTWTPAA和SLMUTPAA处理培养物的方案。（B）用食物或无脂饮食喂养的小鼠的治疗方案。用PBS、BTWTPAA或SLMUTPAA对无脂肪饮食小鼠进行管饲。（C）盲肠内容物、结肠和肝脏组织的共焦图像。通过与Alexa Fluor-647叠氮化物（红色）的化学连接，显现出来源于多形拟杆菌的带有炔基的代谢物。Hoechst 33342（蓝色）用作DNA染色剂。（D）高分辨率质谱离子色谱图，证明BTWTPAA样品中高丝氨酸衍生的鞘脂代谢转移至结肠和肝组织，在CHOW、PBS和SLMUTPAA样品中不存在这种脂质。

(3) 多形拟杆菌合成转移到宿主组织的含高丝氨酸的鞘脂

将同位素标记的L-丝氨酸喂给BTWT导致基于丝氨酸的SLs的有效标记；然而，丝氨酸不能标记未知的DHCer（图3A，3B，3B）。SPT依赖的代谢物不是来源于丙氨酸、甘氨酸或半胱氨酸。喂食同位素标记的L-丙氨酸、L-甘氨酸和L-半胱氨酸未能标记DHCer。C13同位素富集的L-苏氨酸在17.4分钟的保留时间（rt）成功标记了DHCer，证实了苏氨酸作为鞘脂生物合成的用途（图3A、3B、3B）。氨基酸选择性SLs生物合成表明，高丝氨酸衍生的SLs的命运不同于丝氨酸构建的SLs，因为DHCer-PEs和DHCer-PI是由丝氨酸构建；然而，在高丝氨酸衍生的SLs中仅观察到DHCer-PI(图3D和S4)。

（A）本研究中使用的同位素标记的氨基酸，用星号（*）标记标记的原子。（B）通过氨基酸选择性生物合成在BTWT和SLMUT检测到的高丝氨酸和苏氨酸衍生的二氢神经酰胺的离子色谱图和代表性结构。红色和紫色星号（*）分别标记通过重L-天冬氨酸和L-苏氨酸喂食观察到的同位素标记。（C）氨基酸选择性鞘脂生物合成方案。（D）氨基酸选择性鞘脂生物合成证明了在体内基于高丝氨酸的DHCer被转化为DHCer-PI而不是DHCer-PE。

(4) 高丝氨酸鞘脂改变肝细胞中的氧化呼吸和脂肪积累

为了揭示高丝氨酸-DHCer对肝细胞代谢的分子机制，用高丝氨酸-DHCer处理的HepG2细胞进行RNA-seq，基因集合富集分析（GSEA）显示了参与氧化磷酸化、脂肪酸代谢和糖酵解途径（图4A）。这些结果表明逆转了高糖/脂肪酸诱导的能量异常。进一步分析显示，参与β-氧化和SLs代谢的基因上调，参与脂肪酸合成和转运的基因下调（图4B）。根据这些发现，我们设想高丝氨酸-DHCer促进线粒体呼吸，这种活性在蔗糖处理的HepG2细胞中被抑制。为此，我们测量了这些肝细胞的耗氧率（OCR），与对照细胞相比，高丝氨酸-DHCer处理的肝细胞显示呼吸增加（图4C-D）。总之，这些结果表明高丝氨酸-DHCer调节肝细胞的代谢需求。

（A）高丝氨酸-DHCer（hsDHCer）处理的HepG2细胞中富集的基因。（B）如（A）中所述处理的HepG2细胞中显著上调或下调基因的表达热图。（C）用hsDHCer、作为载体对照的乙醇（载体，EtOH）或未处理（对照）处理的蔗糖调节的HepG2细胞的耗氧率（OCR）。（D）在与（C）相同的条件下，基于细胞OCR的海马检测，基础呼吸、ATP产生和最大呼吸。

(5) 脂肪酸代谢因微生物在鞘脂合成中的活跃而发生改变

与SLMUTPAA和对照小鼠相比，BTWTPAA小鼠含有显著更高水平的酰基肉碱（图5A）。酰基肉碱是由肉碱棕榈酰转移酶产生，并且细胞的高丝氨酸-DHCer处理上调肉碱棕榈酰转移酶（CPT1）基因表达（图4B）。BTWTPAA样品中的Cpt1水平明显高于SLMUTPAA和对照小鼠，这表明Cpt1活性的增加是酰基肉碱水平和BTWTPAA特异性宿主调节生物学之间的潜在联系（图5B）。此外，在喂食没有细菌干预食物的小鼠中，酰基肉碱和Cpt1水平与在无脂肪饮食中接受BTWTPAA治疗的小鼠相似。此外，CPT1活性和肉碱水平增加是脂肪酸加工和线粒体β-氧化增加的标志，表明细菌鞘脂在调节结肠中宿主脂质加工中起到重要作用。

给小鼠喂食食物或无脂肪食物。接受无脂饮食的小鼠用PBS、BTWTPAA或SLMUTPAA灌胃。（A）来自处理样品的丁酰基、己酰基和棕榈酰基肉毒碱的相对测量值。（B）治疗后通过RT-qPCR测量的小鼠结肠组织中Cpt1的相对基因表达。

(6) 肠道微生物产生的鞘脂可以改善饮食引起的肝脂肪变性

为了了解细菌SLs生物合成和从肠道微生物转移的更广泛的代谢结果，研究人员监测了肝脏脂质依赖的代谢表型。两周的无脂饮食导致过量的肝脏脂质积累和肝脏脂肪变性的发作。喂食无脂肪饮食（0%脂肪、75.9%碳水化合物和24.1%蛋白质）一个月的小鼠与喂食食物饮食（23.7%脂肪、53.2%碳水化合物、23.1%蛋白质）的小鼠相比，肝脏脂质积累显著增加，如H&E染色（图6A）和肝脏甘油三酯水平定量（图6B）所示。当每天用BTWTPAA治疗小鼠7天时，给予无脂饮食的小鼠中过量的脂质积累得到改善（图6A和图6B）。BTWTPAA小鼠的肝脏甘油三酯水平明显低于SLMUTPAA小鼠，并且肝脏甘油三酯水平与喂食食物的小鼠的肝脏甘油三酯水平没有区别（图6B）。还观察到参与脂质代谢的基因表达随着BTWTPAA处理而显著改变（图6D）。比较BTWTPAA和SLMUTPAA小鼠肝脏转录组的RNA-seq分析揭示了与神经酰胺合成（图6E）和线粒体β-氧化（图6F）相关的基因在BTWTPAA条件下以显著更高的水平表达。与用BTWT来源的高丝氨酸-DHCer处理的肝细胞中观察到的结果一致（图4B），Cpt1表达在BTWTPAA状态下上调（图6D）。与SLMUTPAA小鼠相比，参与炎症（图6G）和甘油磷脂代谢（图6H）的基因在BTWTPAA小鼠中的表达水平明显较低。这些观察到的基因表达变化与BTWTPAA小鼠结肠中肉碱水平改变的观察结果（图5A）相结合，确定了细菌鞘脂合成在影响宿主途径中的作用，这种作用作为观察到的肝脏脂质表型的间接贡献者。总之，来自细菌的鞘脂转移可能通过驱动脂肪生成向β-氧化的转换，直接或间接减少无脂饮食诱导的肝脏脂质积累。

给小鼠喂食食物或无脂肪食物。接受无脂饮食的小鼠用PBS、BTWTPAA或SLMUTPAA灌胃。（A）在上述处理后对横切面肝组织进行苏木精和曙红染色。（B）甘油三酯含量。（C）参与脂肪酸代谢的各种酶的示意图。（D）与SLMUTPAA小鼠相比，BTWTPAA中显著差异表达的肝脏基因的热图。（E）鞘脂代谢、（F）β-氧化、（G）炎症和（H）甘油磷脂代谢途径的显著差异表达基因的Log2倍变化（FC）的结果。

这项研究证明了肠道共生细菌整合苏氨酸或高丝氨酸产生的鞘脂可以转移到宿主的结肠和肝脏，高丝氨酸-DHCer能够增强肝细胞的线粒体呼吸，并改善过量蔗糖处理的肝细胞代谢表型。在小鼠模型中，含高丝氨酸的细菌鞘脂转移与肝脏脂肪变性的缓解相关。研究通过创新的实验设计和详细的分析方法，为研究其他宿主-微生物相互作用系统中代谢物转移和对宿主表型的影响提供了参考，同时也为细菌的鞘脂在宿主代谢中的作用提供了新的见解，并为未来基于微生物治疗的研究，尤其是针对代谢相关疾病的研究提供了重要的基础。基于该研究的成果，接下来的研究可以扩展监测的脂质范围，识别更多可能转移到宿主组织的鞘脂，探讨不同饮食条件下细菌的脂质转移的动态变化，研究其他源于细菌的鞘脂或代谢物对宿主表型的影响。

(1) 细菌的鞘脂不仅可以转移到宿主组织，还能通过调节能量代谢和脂质积累来影响宿主的肝脏功能。

(2) 细菌的鞘脂通过多种机制影响宿主的表型，包括促进其他代谢物的转移和宿主对细菌产生的鞘脂的感知。

(3) 细菌的鞘脂代谢对宿主的代谢非常重要，发现了潜在的应用价值，为开发新的基于微生物的治疗策略提供了新思路。

Le HH, Lee MT, Besler KR, Johnson EL. Host hepatic metabolism is modulated by gut microbiota-derived sphingolipids. Cell Host Microbe. 2022 Jun 8;30（6）:798-808.e7. doi: 10.1016/j.chom.2022.05.002. Epub 2022 May 26. PMID: 35623356; PMCID: PMC9187616.

Pubmed链接：

本研究涉及的鞘脂及鞘脂相关代谢物检测、real-time PCR及转录组相关实验等均可由君飞科技提供，并根据具体研究内容提供解决方案。

来源：办公室健康