摘要：研究表明，微生物活性与重金属的生物利用度之间存在密切关系，且重金属抗性基因能够影响重金属的活性。研究采用了BCR连续提取法对镉形态进行分类，并利用重金属基因芯片技术对镉抗性基因进行了定量测定。结果表明，堆肥过程中蚯蚓生物量的变化可通过逻辑模型进行充分拟合，且添

Changes in Cd forms and Cd resistance genes in municipal sludge duringcoupled earthworm and biochar composting

在耦合蚯蚓和生物炭堆肥过程中市政污泥中镉形态和镉抗性基因的变化

作者：Zhimin Yu， Meng Zhou， Hongwei Zhang， Lei Yuan， Pin Lv，

Limin Wang， Jizhou Zhang

期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety

时间：2024.10.14

影响因子：6.2

DIO：10.1016/j.ecoenv.2024.117179

摘要

研究表明，微生物活性与重金属的生物利用度之间存在密切关系，且重金属抗性基因能够影响重金属的活性。研究采用了BCR连续提取法对镉形态进行分类，并利用重金属基因芯片技术对镉抗性基因进行了定量测定。结果表明，堆肥过程中蚯蚓生物量的变化可通过逻辑模型进行充分拟合，且添加生物炭有效增加了蚯蚓的生物量。蚯蚓与生物炭的联合处理促进了污泥的降解。该联合处理降低了酸可提取态和可还原态镉占总镉的比例，增加了氧化态和残留态镉占总镉的比例，实现了镉形态从活性向惰性的转化，并减少了镉抗性基因的基因拷贝数。其中，czcB被确定为影响酸可提取态镉和残留态镉含量的关键基因；czcA、czcB、czcD和czcS被确定为影响可还原态镉含量的关键基因；czrR和cadA被确定为影响氧化态镉含量的关键基因；而czcC被确定为影响总镉含量的关键基因。镉抗性基因可直接影响镉的形态，也可通过它们之间的相互作用间接影响镉的形态。

方法及内容

1.原材料的收集与处理

实验所需材料包括污水污泥、玉米秸秆、生物炭和赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）。

2.实验设计

完成预堆肥后，进行堆肥实验。设置四个实验组：（1）CK组（混合物料），不添加蚯蚓和生物炭；（2）B处理组，添加生物炭；（3）E处理组，添加蚯蚓；（4）BE处理组，同时添加生物炭和蚯蚓。每个蚯蚓反应器置于湿度为75%的温室中培养60天，每3天添加一次超纯水以保持基质湿度基本恒定。每个处理步骤重复5次，并选择三组一致性较好的数据进行统计分析。

3.样品收集

在第15、30、45和60天，取出蚯蚓并彻底清洗。清空肠道后称量蚯蚓的生物量。随后，将蚯蚓放回继续实验。在第30和60天，从E组和BE组的反应器中各取出8只蚯蚓。将这些蚯蚓冷冻干燥后，用球磨机研磨以备后续使用。

在第30和60天收集堆肥材料，一部分材料用于基因芯片分析；另一部分材料风干后，用球磨机研磨，储存用于分析不同形态的镉和化学指标。

根据公式计算蚯蚓对镉的生物富集因子（BAF）。

4.测试样品分析

测定风干样品的pH值和电导率。使用元素分析仪测定总碳和总氮含量。采用BCR连续提取法提取不同形态的镉。其中镉被分为四种形态：F1代表酸可提取态，F2代表可还原态，F3代表可氧化态，F4代表残渣态。使用石墨炉原子吸收分光光度计测定提取的镉溶液。进行堆肥样品中重金属基因芯片的检测。

5.数据分析

所有数据均以平均值±标准差（SD）表示。文中数据采用SPSS 20.0进行分析。在P

结果

1.蚯蚓与生物炭联合堆肥对蚯蚓生物量的影响

图1展示了堆肥过程中蚯蚓生物量的变化。随着堆肥的进行，E组和BE组处理中的蚯蚓生物量显著增加。E组和BE组通过逻辑方程拟合得到的拟合度很高。此过程经历了三个阶段：潜伏期、快速增长期和平衡期。

图1. E 和 BE 处理组在蚯蚓堆肥过程中蚯蚓生物量的变化。实线和虚线表示逻辑模型的拟合趋势

在堆肥过程中，BE处理组的蚯蚓生物量大于E处理组。在堆肥的第45天和第60天，两组处理之间的差异显著（P<0.05）。堆肥结束时，蚯蚓生物量达到最大值。

2.蚯蚓与生物炭联合堆肥对污泥中总有机碳（TOC）、总氮（TN）和碳氮比（C/N）的影响

表1展示了堆肥过程中各材料总有机碳（TOC）、总氮（TN）和碳氮比（C/N）的变化情况。各处理组材料的总有机碳含量均逐渐降低。堆肥结束时，与对照组（CK）及B组、E组和BE组相比，其TOC含量均降低。在这些组中，添加生物炭的处理组的TOC含量显著高于未添加生物炭的处理组（P

E组材料的总氮含量逐渐降低，而其他处理组的总氮含量则先增加后降低。各处理组与对照组之间的差异显著（P

对于未添加蚯蚓的处理组，其碳氮比先下降后上升，而添加了蚯蚓的处理组（的碳氮比则逐渐下降。添加蚯蚓的处理组与未添加蚯蚓的处理组之间存在显著差异（PP

表1.材料在蚯蚓与生物炭联合堆肥过程中主要化学指标的变化

注：数据以三个重复的平均值±标准差表示。不同字母表示四个处理组之间存在显著差异（P

3.材料中镉形态的变化

图2显示了堆肥过程中不同形态镉占总镉含量的百分比。堆肥开始时，初始堆肥材料中酸可提取态镉、可还原态镉、可氧化态镉和残余态镉占总镉的比例分别为21.2%、32.2%、16.7%和30.0%。其中，酸可提取态镉和可还原态镉是镉的活性形态，而可氧化态镉和残余态镉是镉的惰性形态。在初始材料中，活性镉占总镉含量的53.4%，惰性镉占总镉含量的46.6%。

随着堆肥的进行，对照组中的F1/T呈现出先增加后减少的趋势；CK组中的F2/T显著降低；CK组中的F3/T逐渐增加；CK组中的F4/T呈现出先减少后增加的趋势。

图2. 蚯蚓堆肥过程中第(a)0天、(b)30天和(c)60天不同形态镉（Cd）占总镉含量的百分比。F1/T表示酸可提取态镉占总镉的百分比，F2/T表示可还原态镉占总镉的百分比，F3/T表示可氧化态镉占总镉的百分比，F4/T表示残留态镉占总镉的百分比

4.蚯蚓对镉（Cd）的生物富集系数（BAF）

图3展示了E组和BE组在堆肥过程中生物富集系数（BAF）的变化。在蚯蚓堆肥过程中，E组和BE组的BAF逐渐上升。BE组的BAF高于E组，但两者之间没有显著差异（P>0.05）。实验结束时，E组和BE组的BAF分别为1.82 ± 0.10和1.89 ± 0.07，这表明蚯蚓能够有效地在市政污泥中富集镉。

图3. 堆肥过程中镉（Cd）生物富集系数（BAF）的变化。BAF代表蚯蚓对镉的生物富集系数，是蚯蚓体内镉浓度与物料中镉浓度的比值。相同字母表示E组和BE处理组之间无显著差异（P > 0.05）

5.污泥中镉抗性基因表达的变化

本研究利用金属抗性基因芯片技术共检测到9种镉抗性基因。

图4展示了czc系列镉抗性基因的变化。所有处理组中czcA基因的拷贝数均随堆肥过程而减少（图4a）。所有处理组中czcB基因的拷贝数均呈现先增加后减少的趋势（图4b）。CK组和B组中czcC基因的拷贝数呈现先减少后增加的趋势，而E组和BE组中czcC基因的拷贝数在堆肥过程中持续减少（图4c）。随着堆肥的进行，各处理组中czcD基因的拷贝数均有所减少（图4d）。zcS基因在对照组（CK）中的拷贝数呈现先减少后增加的趋势，而在其他处理组中则逐渐减少（图4e）。图5展示了czr系列和其他镉抗性基因的变化过程。czrA基因在对照组中的拷贝数呈现先增加后减少的趋势，而在其他处理组中则逐渐减少（图5a）。czrR基因在所有处理组中的拷贝数在堆肥过程中均减少（图5b）。cadA基因在所有处理组中的拷贝数在堆肥过程中均减少（图5c）。zntA基因在所有处理组中的拷贝数在堆肥过程中均减少（图5d）。图3展示了堆肥过程中镉（Cd）生物富集系数（BAF）的变化。BAF代表蚯蚓对镉的生物富集系数，是蚯蚓体内镉浓度与物料中镉浓度的比值。相同字母表示E组和BE组之间无显著差异（P> 0.05）。

综上所述，B、E和BE处理减少了镉抗性基因的拷贝数，这与镉的可还原态变化（图2）相一致。

图4. 堆肥过程中czc系列中几种镉抗性基因表达量的变化：(a) czcA，(b) czcB，(c) czcC，(d) czcD，和(e) czcS，它们代表czc系列中的镉抗性基因。不同字母表示四个处理组之间存在显著差异（P

6.关键镉抗性基因对镉形态的影响

图5展示了镉抗性基因与不同镉形态之间的皮尔逊相关性。结果表明，酸可提取态和可还原态镉含量与镉抗性基因表达正相关，而氧化态和残留态镉含量与镉抗性基因表达负相关。抗性基因主要通过影响可还原态和氧化态镉来改变镉的形态。

镉抗性基因与镉形态之间存在复杂的相关性。关键镉抗性基因与镉形态之间存在强相关性（表2和图6，R²回归系数均大于0.5，P值显著）。

如图6所示，czcB是影响酸可提取态镉和残留态镉含量的关键镉抗性基因，直接影响酸可提取态镉和残留态镉的转化。czc系列中的czcA、czcB、czcD和czcS基因是影响可还原态镉的关键抗性基因，可以直接影响可还原态镉含量，并通过基因内部相互作用间接影响可还原态镉含量。czrR和cadA是影响氧化态镉的关键镉抗性基因，可以直接或间接（通过内部相互作用）影响氧化态镉含量。czcC是影响总镉的关键镉抗性基因。上述结果得到了皮尔逊相关性分析结果（图5）的支持。

图5. 其他镉抗性基因在堆肥过程中的变化，包括（a）czrA、（b）czrR、（c）cadA和（d）zntA，它们代表不同的镉抗性基因。图中不同字母表示四个处理之间存在显著差异（P

图6. 镉形态与镉抗性基因之间的相关性。* 表示P P

表2 镉抗性基因影响镉形态的逐步回归分析（n = 9）

注：* P P

结论

添加生物炭在蚯蚓堆肥过程中显著增加了赤子爱胜蚓的生物量。将蚯蚓与生物炭联合堆肥促进了污泥的降解，使镉的形态从活性态转变为惰性态，并降低了镉抗性基因（czcA、czcB、czcC、czcD、czcS、czrA、czrR、cadA和zntA）的基因拷贝数。其中，czcB是一个影响可酸提取态镉和残留态镉含量的关键基因；czcA、czcB、czcD和czcS是影响可还原态镉含量的关键基因；czrR和cadA是影响可氧化态镉含量的关键基因。此外，czcC是影响总镉含量的关键基因。镉抗性基因直接影响镉的形态，或通过它们之间的相互作用间接影响镉的形态。

来源：图拉