摘要：人类肠道BEST4/CA7⁺细胞是一类肠道上皮细胞，其基因表达谱提示可能在电解质平衡中发挥重要作用，但其具体功能尚未得到实验验证。荷兰Hubrecht研究所Hans Clevers团队在《Cell Stem Cell》期刊发表最新研究成果，通过体外肠道类器官模
人类肠道BEST4/CA7⁺细胞是一类肠道上皮细胞，其基因表达谱提示可能在电解质平衡中发挥重要作用，但其具体功能尚未得到实验验证。荷兰Hubrecht研究所Hans Clevers团队在《Cell Stem Cell》期刊发表最新研究成果，通过体外肠道类器官模型揭示了BEST4/CA7⁺细胞的分化机制和功能特性。研究发现，BEST4/CA7⁺细胞的分化依赖Notch信号通路和转录因子SPIB，且能被干扰素γ（IFN-γ）显著扩增，表明其在免疫反应中具有重要作用。此外，研究还证实小肠中的BEST4/CA7⁺细胞通过CFTR介导的液体外流控制电解质/液体稳态，并在细菌毒素刺激下发挥关键作用。这一发现为理解肠道上皮细胞在液体稳态和细菌感染中的作用提供了新的视角。
文章介绍
题目：干扰素反应性肠道BEST4/CA7+细胞是细菌性腹泻毒素的靶标
杂志：Cell Stem Cell
影响因子：19.8
发表时间：2025年2月
#1
研究背景
Background
BEST4/CA7⁺细胞是人类肠道中的一种稀有上皮细胞，其基因表达谱提示可能在电解质平衡和液体稳态中发挥重要作用。然而，由于缺乏合适的体外模型和小鼠中的同源细胞，其分化机制和功能特性尚未得到深入研究。此外，尽管细菌性腹泻毒素通过激活CFTR通道导致肠道液体分泌失衡，但人类肠道中是否存在专门调节液体稳态的细胞类型仍不清楚。BEST4/CA7⁺细胞高表达CFTR和GUCY2C，使其成为研究细菌性腹泻的关键靶点。然而，其在肠道免疫反应和液体稳态中的具体作用机制尚未明确。本研究将通过构建基因修饰的人类肠道类器官模型，研究了BEST4/CA7⁺细胞的特性，并将其鉴定为一种1型免疫反应细胞类型。这种细胞能够调控电解质/液体稳态，并且是人类肠道中细菌性腹泻毒素的细胞靶点。
#2
研究思路
Methods
本研究首先利用单细胞RNA测序、体外肠道类器官和体内模型，结合CRISPR基因编辑技术、荧光报告系统、细胞分选以及单细胞转录组测序等技术，系统性地揭示了BEST4/CA7⁺细胞的分化机制，以及在维持肠道液体稳态中的关键作用。
#3
研究结果
Results
1. 建立含有BEST4/CA7⁺细胞的人类肠道类器官模型
人类肠道类器官用一组确定的生长因子（图1A，称为“扩增培养基”）培养，以维持长期的自我更新干细胞和瞬时扩增（TA）细胞。为了确定含BEST4/CA7+细胞的类器官的培养条件，从生长因子混合物中去除了自我更新因子（图1A）。这种被称为“分化培养基”的培养基在6-8天内诱导了干细胞向多种细胞系的强烈分化。肠细胞（由CYP3A4、CD36和FABP1标记）、杯状细胞（由MUC2和TFF3标记）和肠内分泌细胞（EEC，由CHGA和TPH1标记）标记物的表达证实了对主要肠细胞类型的有效诱导。通过在类器官中使用CHGA抗体进行全套免疫荧光染色，进一步证实了EEC和杯状细胞的存在。在去除自我更新因子混合物后，干细胞（由LGR5和OLFM4标记）和TA细胞（由MKI67和PCNA标记）标记基因的表达降低。
图1 含有BEST4/CA7⁺细胞的人类肠道类器官模型。
2. BEST4/CA7⁺细胞报告类器官的生成
为了更好地观察和进一步研究BEST4/CA7⁺细胞，通过CRISPR辅助的非同源末端连接（NHEJ）方法，在CA7基因的C末端敲入了P2A-tdTomato报告盒，生成了报告类器官。通过靶向基因分型和免疫荧光染色，验证了CA7位点的敲入成功，并确认报告系统能够准确标记BEST4/CA7⁺细胞。流式细胞分选显示，分化的类器官中约有1%的tdTomato⁺细胞，这些细胞表达多个BEST4/CA7⁺细胞的标记基因；细胞根据标记基因分为四类：肠上皮细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞和BEST4/CA7⁺细胞。小肠中的BEST4/CA7⁺细胞特异性表达ADGRG4、KRT72、CPA2和CFTR基因，CFTR编码的Cl⁻/HCO₃⁻通道与囊性纤维化相关。研究还从小肠和结肠类器官中分选了BEST4/CA7⁺细胞，并通过qPCR比较了两者的标记基因表达，结果显示小肠来源的BEST4/CA7⁺细胞表达更高水平的CFTR、ADGRG4、KRT72和CPA2。这些实验表明，分化的肠道类器官中确实存在具有独特基因表达特征的BEST4/CA7⁺细胞（图2）。
图2 使用敲入报告类器官对BEST4/CA7⁺细胞的特性进行鉴定。
3. Notch信号通路对BEST4/CA7⁺细胞分化至关重要
肠道上皮细胞的稳态由多种生态位信号共同维持。通过使用报告类器官模型,评估了多种生态位信号通路对BEST4/CA7⁺细胞生成的影响，并通过FACS分析进行定量。在分化过程中向培养基中添加不同的生态位因子。添加替代WNT蛋白显著抑制了BEST4/CA7⁺细胞的分化，表明WNT信号是类器官扩增的关键因子。使用γ-分泌酶抑制剂DAPT完全阻止了BEST4/CA7⁺细胞的分化，表明Notch信号对BEST4/CA7⁺细胞生成至关重要。Notch信号的激活依赖于细胞间的直接通讯，且BEST4/CA7⁺细胞高表达Notch受体NOTCH2，与杯状细胞相邻，而杯状细胞表达Notch配体。BMP-2/4抑制了BEST4/CA7⁺细胞的生成，而Noggin（BMP抑制蛋白）促进了BEST4/CA7⁺细胞的生成，表明BMP信号负向调控这些细胞的生成。BEST4/CA7⁺细胞高表达FKBP1A，作为雷帕霉素结合蛋白，它抑制mTOR信号通路。添加雷帕霉素显著抑制了BEST4/CA7⁺细胞的分化，而通过激活mTOR（如使用MHY-1485）增加了BEST4/CA7⁺细胞的生成（图3）。
图3 Notch信号通路对BEST4/CA7⁺细胞分化至关重要。
４. BEST4/CA7⁺细胞在SPIB基因敲除类器官中缺失
通过单细胞RNA测序分析，研究发现原发性组织和类器官中的BEST4/CA7⁺细胞特异性表达转录因子SPIB。为了探讨SPIB在细胞命运决定中的作用，使用CRISPR技术生成了SPIB基因敲除的类器官。结果表明，SPIB的敲除导致类器官中BEST4/CA7⁺细胞的完全丢失。为排除CRISPR脱靶效应，引入了四环素诱导的SPIB过表达载体，特异性地恢复了SPIB-KO类器官中BEST4/CA7⁺细胞的生成。免疫荧光染色和qPCR分析进一步证实了SPIB-KO类器官中BEST4/CA7⁺细胞群体的缺失。为了进一步验证这一发现，在第二个供体的小肠类器官中进行了验证。qPCR分析显示，SPIB缺失对其他细胞谱系（如肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞）的标记基因表达没有显著影响。基于这些结果，研究进一步比较了SPIB-KO类器官（缺乏BEST4/CA7⁺细胞）与野生型类器官（含有BEST4/CA7⁺细胞）之间的差异，为后续的BEST4/CA7⁺细胞功能研究提供了重要的实验基础（图4）。
图4 SPIB基因敲除类器官中缺失BEST4/CA7⁺细胞。
5. BEST4/CA7⁺细胞对1型免疫因子IFN-γ的响应性
BEST4/CA7⁺细胞在健康肠道上皮中占少数，此前的研究表明，tuft细胞和M细胞是两种表达SPIB的细胞类型，它们在特定的免疫信号刺激下可以增多。tuft细胞增殖受到IL-4/13的诱导，而M细胞分化则依赖于RANKL。目前尚不清楚BEST4/CA7⁺细胞是否对炎症信号敏感。通过在BEST4/CA7⁺细胞报告类器官中筛选一系列细胞因子，发现IFN-γ显著增加BEST4/CA7⁺细胞的数量，扩增倍数超过8倍，并通过剂量反应和时间过程实验进一步验证了这一效果。IL-22也能促进BEST4/CA7⁺细胞增殖，但效应较IFN-γ弱。相比之下，TNF-α显著抑制了BEST4/CA7⁺细胞的分化。IFN-γ诱导的细胞扩增特异性地作用于BEST4/CA7⁺细胞群体，并且该过程依赖于SPIB，因为在SPIB-KO类器官中这一过程被完全阻断。
进一步实验表明，IFN-γ并未影响其他肠道分泌细胞谱系的数量。通过报告类器官中的实验发现，IFN-γ对BEST4/CA7⁺细胞的增殖具有高度特异性。BMP-2/4、DAPT和雷帕霉素等在IFN-γ存在的条件下依然抑制BEST4/CA7⁺细胞的分化。IL-4和RANKL对BEST4/CA7⁺细胞分化具有强烈的抑制作用。为了进一步验证这些发现，生成了报告类器官，标记所有SPIB⁺细胞类型。实验结果显示，在分化培养基中，所有SPIB⁺细胞均为BEST4/CA7⁺细胞，且AVIL⁺tuft细胞缺失。添加IL-4后，SPIB⁺细胞谱系完全转变为AVIL⁺tuft细胞，而添加RANKL则导致大部分SPIB⁺细胞转变为GP2⁺成熟M细胞。
尽管SPIB对于BEST4/CA7⁺细胞的生成至关重要，但仅凭SPIB的过表达并不足以诱导BEST4/CA7⁺细胞谱系的形成，因为在SPIB过表达的细胞中，BEST4/CA7⁺细胞的比例仅增加了1.6倍。SPIB过表达并未显著诱导M细胞或tuft细胞的形成。SPIB过表达后，未成熟M细胞标记基因CCL23的表达有所上调，但未成熟M细胞和成熟M细胞的其他标记基因并未发生变化，也未见tuft细胞标记基因的上调。因此，尽管SPIB对这些细胞谱系的生成是必需的，仍然需要其他转录因子共同作用才能完成分化过程（图5）。
图5 BEST4/CA7⁺细胞对1型免疫因子IFN-γ的响应性。
6. IFN-γ诱导的BEST4/CA7⁺细胞的单细胞RNA测序分析
为了在转录组水平上探究IFN-γ对BEST4/CA7⁺细胞的影响，将分化培养基中添加或未添加IFN-γ的类器官细胞通过流式细胞分选进行单细胞RNA测序分析。结果显示，IFN-γ诱导的BEST4/CA7⁺细胞与未诱导的细胞在转录组水平上表现出高度相似性，其标记基因的表达水平未发生显著变化。进一步将类器官来源的BEST4/CA7⁺细胞与原发性组织中的同类细胞进行比较，发现它们在转录组特征上高度一致，这进一步证实了类器官模型的准确性和代表性。
研究还发现，IFN-γ诱导的BEST4/CA7⁺细胞扩增并非通过细胞自我复制实现，而是由干细胞/TA细胞分化而来。活细胞追踪实验表明，新生成的BEST4/CA7⁺细胞主要来源于未分化的干细胞/TA细胞，且在形成后24 h内未检测到增殖行为。此外，通过核苷酸脉冲追踪实验（BrdU/EdU标记）进一步确认了这一结论。
通过对IFN-γ诱导的BEST4/CA7⁺细胞与未诱导细胞的差异表达基因分析，发现仅43个基因表达水平发生显著变化，其中“抗原呈递相关基因”显著富集。这些基因是已知的IFN-γ靶基因，表明IFN-γ可能通过调节免疫相关通路影响BEST4/CA7⁺细胞的功能。此外，研究还发现，高BEST4/CA7⁺细胞比例的原发性组织中，IFN-γ诱导基因的表达水平更高，这提示IFN-γ诱导的BEST4/CA7⁺细胞扩增现象在体内也可能发生（图6）。
图6 IFN-γ诱导的BEST4/CA7⁺细胞的单细胞RNA测序分析。
7. BEST4/CA7⁺细胞是细菌性腹泻毒素的细胞靶点
BEST4/CA7⁺细胞是细菌性腹泻毒素的主要靶点，特别是在肠致病性大肠杆菌（ETEC）感染过程中。与小鼠肠上皮细胞不同，BEST4/CA7⁺细胞是人类小肠中唯一高表达CFTR的细胞类型。在病理状态下，细菌毒素通过多种机制作用于CFTR，进而破坏液体稳态。ETEC通过其热稳定肠毒素（STa）靶向GUCY2C，激活CFTR并导致其磷酸化。GUCY2C不仅在BEST4/CA7⁺细胞中表达，同时也在肠内分泌细胞中高表达，但肠内分泌细胞不表达CFTR。实验表明，GUCY2C的表达和CFTR在BEST4/CA7⁺细胞的顶膜上高度集中，提示STa可能通过这些细胞发挥作用。
通过类器官模型进一步的实验验证了STa通过影响CFTR介导的液体流动导致类器官膨胀。利那洛肽作为STa的类似物，可诱导类器官水分流入，且此过程可被CFTR抑制剂完全阻断。长期阻断CFTR功能会显著减少BEST4/CA7⁺细胞的数量。BEST4基因敲除也导致BEST4/CA7⁺细胞的显著丢失，而CA7基因敲除影响较小，显示BEST4/CA7⁺细胞对液体稳态的调节依赖于CFTR的功能。进一步实验显示，GUCY2C基因敲除的类器官无法正常膨胀，证实了GUCY2C在此过程中的关键作用。
为了验证类器官膨胀是否由BEST4/CA7⁺细胞介导，SPIB-KO类器官（缺乏BEST4/CA7⁺细胞）未能展示膨胀反应，表明BEST4/CA7⁺细胞是液体稳态失衡的重要细胞。霍乱毒素（CTX）通过CFTR激活并促进液体流出，导致类器官膨胀，这一反应也由BEST4/CA7⁺细胞介导。针对CTX的反应可以通过ADRA2A信号通路进行调节，因为去甲肾上腺素通过抑制cAMP信号通路有效阻断了CTX诱导的类器官膨胀，提示ADRA2A可能在调节BEST4/CA7⁺细胞中的电解质和液体稳态中发挥重要作用（图7）。
图7 BEST4/CA7⁺细胞控制电解质/液体稳态。
小结
本研究通过体外肠道类器官模型和基因编辑技术，揭示了IFN-γ对人类肠道BEST4/CA7⁺细胞的调控机制。IFN-γ能够显著扩增BEST4/CA7⁺细胞群体，并通过激活Notch信号通路和转录因子SPIB促进其分化。此外，BEST4/CA7⁺细胞在维持肠道电解质/液体稳态中发挥关键作用，尤其是在细菌性腹泻毒素刺激下，通过CFTR通道介导的液体分泌来调节肠道液体平衡。通过干预相关信号通路，可以有效抑制BEST4/CA7⁺细胞介导的液体分泌，为预防和治疗细菌性腹泻提供了新的靶点。
参考文献
Wang D, Spoelstra WK, Lin L, Akkerman N, Krueger D, Dayton T, van Zon JS, Tans SJ, van Es JH, Clevers H. Interferon-responsive intestinal BEST4/CA7+ cells are targets of bacterial diarrheal toxins. Cell Stem Cell. 2025 Feb 24:S1934-5909(25)00042-6. doi: 10.1016/j.stem.2025.02.003.
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