摘要：今天推荐的是由延世大学医学院医学科学研究生院生物化学与分子生物学系在2023年3月30日发表于Experimental & Molecular Medicine（2021IF：12.7998，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Kyung-Hee Chun教授，
写在前面
今天推荐的是由延世大学医学院医学科学研究生院生物化学与分子生物学系在2023年3月30日发表于Experimental & Molecular Medicine（2021IF：12.7998，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Kyung-Hee Chun教授，研究表明消融去泛素酶USP15可改善非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎。
研究背景
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是由于脂肪在肝脏中堆积而导致的致命性肝病，如非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化。阐明非酒精性脂肪肝的分子机制对于预防和治疗非酒精性脂肪肝至关重要。
摘要部分
在这里，研究人员观察到，在以高脂饮食（HFD）喂养的小鼠肝脏和非酒精性脂肪肝或NASH患者的肝活检组织中，去泛素酶USP15的表达上调。USP15与FABPs和过脂蛋白等脂质积累蛋白相互作用，减少泛素化，增加其蛋白质稳定性。此外，在肝细胞特异性USP15基因敲除的小鼠中，高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝和果糖/棕榈酸酯/胆固醇/反式脂肪（FPC）饮食诱导的非酒精性脂肪肝的严重程度明显减轻。
研究内容
1.USP15在喂食高脂饮食（HFD）的小鼠肝组织中以及在非酒精性脂肪肝（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝病（NASH）患者的肝脏标本中升高
利用喂食高脂饮食或低脂饮食12周的小鼠肝组织对USP的mRNA表达水平进行了筛查。与正常肝脏相比，脂肪肝中49种去泛素化酶中大多数USP的水平都有所下降。有趣的是，USP50、USP15和USP39的mRNA表达在脂肪肝中有所增加。研究人员还再次证实了USP15在高密度脂蛋白喂养小鼠肝组织中mRNA和蛋白质水平的增加。IHC分析显示，USP15在HFD饥饿小鼠肝细胞胞浆中的表达增加。
在非酒精性脂肪肝和NASH患者的肝组织中也检测到了USP15的表达。在非酒精性脂肪肝和NASH患者的肝细胞中，USP15的mRNA水平升高，USP15蛋白呈梯度增加。在非酒精性脂肪肝和NASH患者群体中，USP15的强表达比例逐渐增加。此外，USP15的增加与NAFLD和NASH阶段的AST和ALT水平以及BMI评分平行。
研究结论：USP15在喂食高脂饮食（HFD）的小鼠肝组织中以及在非酒精性脂肪肝（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝病（NASH）患者的肝脏标本中升高。
2.USP15与脂质累积相关蛋白直接相互作用
研究人员使用AML12小鼠肝细胞进行了质谱分析，以筛选USP15底物。有趣的是，研究人员发现USP15与脂肪酸结合蛋白、FABP4和Perilipin2等脂质代谢相关蛋白相互作用。研究人员通过免疫沉淀实验证实了USP15不仅与FABP4和Perilipin2相互作用，还与在肝细胞中表达的FABP1和Perilipin1相互作用。研究人员还进行了体外GSTpulldown试验，以检测USP15与FABP4和Perilipin1之间的直接相互作用。在非酒精性脂肪肝患者中，FABP4和Perilipin1的mRNA表达也明显上调。
此外，利用公共数据库（GSE89632和GSE48452）分析发现，在脂肪变性和NASH阶段，FABP4和Perilipin1的表达也有所增加，这表明USP15对FABPs和perilipins的调控在非酒精性脂肪肝的发展过程中非常重要。接下来，研究人员测定了非酒精性脂肪肝和NASH患者肝活检组织以及正常肝组织中USP15和Perilipin1的免疫阳性率。USP15在肝细胞胞浆中呈颗粒状染色，在无脂肪滴的肝细胞中表达更强。Perilipin1也在细胞质中表达，但主要集中在脂肪小滴周围。USP15/Perilipin1的表达水平与非酒精性脂肪肝的疾病进展呈平行趋势。此外，USP15和Perilipin1在人体肝脏组织中的表达存在统计学意义上的显著相关性。Perilipin1的表达与肝功能的恶化（如谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平）以及BMI评分有平行相关性。遗憾的是，研究人员无法通过免疫组化检测FABP4的表达。
研究结论：USP15与脂质累积相关蛋白直接相互作用。
3.USP15增加肝细胞中FABPs和Perilipins蛋白的稳定性以及脂质积累
USP15的增加以剂量依赖的方式提高了FABP4或Perilipin1的水平。USP15依赖性降解由26S蛋白酶体复合物介导。当通过靶向USP15的siRNA下调USP15时，蛋白酶体抑制剂MG132可抑制FABP1、FABP4、Perilipin1和Perilipin2的蛋白降解。为了确定siRNA干扰USP15表达导致的FABPs和Perilipins蛋白水平下降是否由于蛋白质半衰期缩短所致，研究人员用蛋白质合成抑制剂环己亚胺处理了细胞。转染了靶向USP15 siRNA的AML12细胞显示出FABPs和过脂蛋白的蛋白半衰期明显缩短。
此外，研究人员还阐明了USP15通过稳定这些蛋白在脂质积累中的功能。研究人员用油酸处理细胞，并对AML12细胞进行ORO染色。结果表明，油酸处理的细胞以剂量依赖的方式积累了大量脂质，而转染USP15 siRNA的细胞则减少了脂质积累。研究人员还证实，棕榈酸处理可诱导小鼠肝细胞中USP15蛋白水平的显著增加。
野生型USP15（USP15 WT）的过表达进一步提高了FABPs和过脂蛋白的蛋白水平，而USP15C298A（USP15的显性阴性形式）没有导致蛋白水平的提高。与之前的数据一致，ORO染色表明过表达USP15 WT会以剂量依赖的方式导致脂质积累增加，而USP15 C298A则不会导致脂质积累。
研究结论：USP15在介导FABPs和过脂蛋白的蛋白质稳定性方面起着关键作用，从而导致脂质积累。
4.USP15通过去泛素化调节FABPs和过脂蛋白的蛋白质稳定性
研究人员推断USP15可通过影响FABPs和过脂蛋白的泛素化状态来调节蛋白质的稳定性。研究人员发现，在AML12细胞和小鼠原代肝细胞中，缺失USP15后，FABPs和过脂蛋白的多泛素化增加。此外，Ni2+NTA pulldown进一步证实USP15确实是FABP4和Perilipin1的去泛素化酶。为了进一步证实USP15介导了FABPs和Perilipins的去泛素化，研究人员使用TUBE-琼脂糖珠来鉴定和分离泛素化的总蛋白。与之前的研究结果一致，通过siRNA敲低USP15导致FABP4和Perilipin2的去泛素化增加。在HEK293细胞中过表达USP15 WT会导致FABP4或Perilipin1泛素化减少，而USP15 C298A不会减少FABP4和Perilipin1的泛素化。与USP15介导的去泛素化实验一致，过表达USP15 WT会显著增加FABP4或Perilipin1的总蛋白水平，而USP15 C298A则会严重降低蛋白水平。
研究结论：FABPs和Perilipins蛋白的稳定性受USP15介导的去泛素化调控。
5.肝脏特异性USP15基因敲除小鼠的PPARγ腺病毒诱导的非酒精性脂肪肝表型减少
为了证实USP15在非酒精性脂肪肝中的功能，研究人员产生了肝脏特异性USP15基因敲除（USP15LKO）小鼠。与WT小鼠相比，USP15LKO小鼠肝脏中的USP15蛋白水平降低，而WT和USP15LKO小鼠脂肪组织中的USP15蛋白水平无明显差异。喂食NFD的WT和USP15LKO小鼠的体重、肝脏重量、肝脏重量与体重之比和肝脏表型没有差异。此外，在NFD下，WT和USP15LKO小鼠血清中的葡萄糖、甘油三酯、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇、谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平也没有差异。
饮食、遗传和化学诱导的小鼠模型通常被用作非酒精性脂肪肝动物模型。研究人员采用腺病毒介导的表达系统过表达特定基因的方法在短时间内诱导非酒精性脂肪肝。研究人员检索了文献，以寻找FABPs和过脂蛋白的可能上游调节因子，以及USP15在肝脏中过表达时诱导非酒精性脂肪肝的靶点。众所周知，PPARγ能上调参与脂肪酸摄取和脂质积累的基因的表达，包括FABP4和Perilipin1。腺病毒介导的PPARγ过表达可诱导小鼠非酒精性脂肪肝。研究人员通过尾静脉将表达PPARγ的腺病毒注射到WT或USP15LKO小鼠体内。与WT小鼠相比，USP15LKO小鼠的PPARγ介导的肝脏脂质积累明显减轻。作为炎症标志物的FABP4和perilipin1表达以及巨噬细胞浸润的增加在USP15LKO小鼠中也有所缓解。USP15LKO小鼠的肝脏重量和肝脏重量与体重的比率也有所降低。USP15LKO小鼠体内与脂肪酸积累相关的基因，如FABPs、过脂蛋白和CD36，以及脂肪生成基因，如FASN、SCD-1、SREBP和PPARγ均显著下调。
研究结论：肝脏特异性USP15基因敲除小鼠的PPARγ腺病毒诱导的非酒精性脂肪肝表型减少。
6.PPARγ-腺病毒诱导的非酒精性脂肪肝表型在与USP15过表达腺病毒联合应用后进一步增加
研究人员进一步检测了USP15过表达对非酒精性脂肪肝发展的影响。将WT或C298A突变的USP15表达腺病毒注射到WT小鼠的尾静脉中，同时注射或不注射PPARγ腺病毒。在没有PPARγ腺病毒的情况下，注射USP15腺病毒或USP15 C298A腺病毒的小鼠肝脏未观察到脂肪肝表型，而注射USP15 C298A腺病毒的小鼠肝脏重量和肝脏与体重的比率略有降低。在PPARγ-adenovirus存在的情况下，注射USP15 WT-adenovirus会显著增强PPARγ-adenovirus的肝脂肪变性效应。有趣的是，给药USP15C298A腺病毒后，PPARγ-腺病毒显著的肝脏脂肪变性作用没有那么强，这表明与过表达USP15C298A相比，在肝脏中过表达USP15 WT会加重肝脏脂肪变性。在注射USP15 WT和PPARγ-adenovirus的肝组织中，甘油三酯和游离脂肪酸的浓度最高。研究人员还证实，注射USP15WT-腺病毒会导致肝组织中FABPs和过脂蛋白的蛋白水平显著增加，而USP15 C298A-腺病毒感染的肝脏中FABPs和过脂蛋白的增加低于USP15 WT。
研究结论：PPARγ-腺病毒诱导的非酒精性脂肪肝表型在与USP15过表达腺病毒联合应用后进一步增加。
7.USP15LKO小鼠的炎症较轻，HFD诱导的非酒精性脂肪肝表型得到改善
服用HFD12周后，WT和USP15LKO小鼠的体重没有明显差异。研究人员测量了WT和USP15LKO小鼠的摄食、饮水、耗氧量、能量消耗和体力活动等代谢参数。WT小鼠的能量消耗在暗周期略高，但其他代谢参数在WT和USP15LKO小鼠之间没有差异。WT小鼠的脂肪组织重量和脂肪组织重量与体重的比率与USP15LKO小鼠相似。
然而，USP15LKO小鼠的肝脏脂肪变性程度较低，肝脏重量和肝脏重量与体重之比低于WT小鼠。USP15LKO小鼠肝脏中甘油三酯和游离脂肪酸的含量也显著降低。肝脏中USP15的消减导致血清ALT浓度明显下降。与WT小鼠相比，USP15LKO小鼠葡萄糖生成、脂肪酸摄取和脂肪生成相关基因的表达明显下调。USP15LKO小鼠肝脏中FABPs和过脂蛋白的蛋白水平也显著降低。研究人员还发现，USP15LKO小鼠参与炎症的因子表达较低。然而，血清中葡萄糖、甘油三酯、FFA和胆固醇的浓度没有变化。进行了葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）以测量葡萄糖稳态，结果发现WT和USP15LKO小鼠的葡萄糖清除率和胰岛素敏感性没有差异。
研究结论：USP15LKO小鼠的炎症较轻，HFD诱导的非酒精性脂肪肝表型得到改善。
8.肝细胞缺失USP15可抑制小鼠NASH模型中的肝脏脂肪变性、炎症和纤维化
由于高脂饮食会诱发轻度炎症和纤维化，研究人员采用了果糖/棕榈酸酯/胆固醇/反式脂肪（FPC）饮食，这种饮食已被证明会诱发更严重的炎症和纤维化。喂食FPC16周后，与WT小鼠相比，喂食FPC的USP15LKO小鼠在体重和脂肪组织重量上没有明显差异。然而，与在HFD模型中观察到的情况类似，USP15LKO小鼠表现出较少的肝脏脂肪变性，肝脏重量和肝脏与体重之比明显低于WT对照组。USP15LKO小鼠肝脏中甘油三酯和游离脂肪酸的含量也低于WT小鼠。肝脏中USP15的消减导致血清ALT/AST浓度明显降低，而血清中甘油三酯、游离脂肪酸和总胆固醇的浓度仅有微小差异。值得注意的是，USP15LKO小鼠肝脏中的脂质积累和胶原沉积明显减少，油红O染色和天狼星红染色分别证实了这一点。此外，与WT对照组相比，USP15LKO小鼠的α-平滑肌肌动蛋白或F4/80炎症标志物的表达也有所降低。值得注意的是，Smad3磷酸化后会直接与胶原蛋白的启动子区域结合，从而促进肝纤维化。USP15LKO小鼠细胞核中SMAD3的磷酸化程度要低得多。研究人员还观察到喂食FPC的小鼠肝脏中FABP4和Perilipin1的表达减少。此外，USP15LKO小鼠中与炎症和纤维化相关的基因表达也因FPC饮食而明显下调。USP15缺乏也导致细胞死亡程度大大降低，TUNEL试验证实了这一点，该试验标记基因组DNA的游离3'-羟基末端，表明细胞凋亡。然而，葡萄糖和胰岛素耐受性测试并未显示肝脏USP15耗竭导致葡萄糖耐受性或胰岛素敏感性增强。
研究结论：消融USP15可改善肝脏脂肪变性，而不会产生明显的全身副作用。
结论与讨论
在本研究中，研究人员认为肝细胞中USP15的缺失不仅会降低FABPs和过脂蛋白的表达，还会抑制TGF-β信号通路和细胞死亡，从而减少炎症和纤维化。有趣的是，HFD或FPC饮食喂养的小鼠的USP15基因敲除肝脏不仅显示炎症反应和纤维化显著降低，而且肝甘油三酯和游离脂肪酸也显著降低.与野生型小鼠相比，喂食HFD或FPC的USP15LKO小鼠体重并无明显差异。用白色脂肪组织测量的脂肪量或用GTT或ITT测量的葡萄糖代谢也没有显示出任何差异。这些发现表明，肝脏USP15在调节肝脏脂质积累和炎症反应方面发挥着重要作用。然而，不应忽视的是，这些表型是在肝脏特异性缺失USP15时表现出来的，而不是在全局性缺失USP15时表现出来的。这种方法可能会减少对全身的毒副作用，但这个问题还需要进一步研究。
Thank you!
全文链接：https://www.nature.com/articles/s12276-023-01036-7
来源：振波讲健康
