摘要：近日，一项发表在《Cell》杂志上的研究揭示了一种新型的蝙蝠冠状病毒BtHKU5-CoV如何利用人类血管紧张素转换酶2（ACE2）受体作为细胞入侵的门户。这一突破性发现不仅为我们揭示了冠状病毒跨种传播的复杂机制，更为预防未来可能的疫情提供了宝贵线索与启示。让我
近日，一项发表在《Cell》杂志上的研究揭示了一种新型的蝙蝠冠状病毒BtHKU5-CoV如何利用人类血管紧张素转换酶2（ACE2）受体作为细胞入侵的门户。这一突破性发现不仅为我们揭示了冠状病毒跨种传播的复杂机制，更为预防未来可能的疫情提供了宝贵线索与启示。让我们一同走进这项激动人心的科学研究，探索蝙蝠冠状病毒BtHKU5-CoV与人类健康之间的微妙联系吧！
文章介绍
题目：蝙蝠感染的merbecovirus HKU5-CoV谱系2可利用人ACE2作为细胞入侵受体
杂志：Cell
影响因子：IF=45.5
发表时间：2025年2月
#1
研究背景
Background
冠状病毒的跨物种传播一直是全球公共卫生的重要威胁之一。蝙蝠因其携带基因多样性冠状病毒（CoV）比例最高，被认为是三种高致病性人类CoV（SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2）的天然宿主。已知ACE2是多种冠状病毒的功能性蛋白受体之一，包括SARS和COVID-19病毒。然而，对于蝙蝠携带的其他冠状病毒如HKU5-CoV-2，是否也利用ACE2受体对人类构成潜在的传播风险，仍需进一步研究。
本研究旨在揭示HKU5-CoV-2病毒与ACE2受体的作用机制，评估其对人类健康的潜在威胁，并为探索新型抗病毒药物及疫苗研发提供科学依据。
#2
研究方法
Methods
研究人员从蝙蝠的肛门拭子样本中筛选出与HKU5-CoV相关的病毒序列，通过全基因组测序和系统发育分析，鉴别出一种新型HKU5-CoV谱系（HKU5-CoV-2）。通过基因突变分析、蛋白质复合物制备和结构解析等，对BtHKU5-CoV的受体结合域（RBD）进行了详细研究。此外，通过假病毒实验和冷冻电镜技术，精确解析了该病毒与人类ACE2受体之间的相互作用。
#3
研究结果
Results
1、蝙蝠中HKU5-CoV独特谱系的发现
通过针对RNA依赖性RNA聚合酶基因的泛冠状病毒（pan-CoV）聚合酶链反应（PCR）对蝙蝠肛拭子样本进行筛查，确定5个与2021年报告的蝙蝠HKU5冠状病毒（样本编号：141441）密切相关的序列。对6份HKU5冠状病毒（HKU5-CoV）样本的二代测序（NGS）数据和Sanger测序结果进行从头组装，获得6份样本的全长基因组序列。这些蝙蝠HKU5-CoV在基因组序列上彼此之间的相似度为97.5%～100%，与HKU5-CoV原型株（HKU5-1，GenBank编号：NC_009020.1）的相似度为78.8%～78.9%。根据最新分类标准，这6种蝙蝠冠状病毒的五个保守复制酶结构域与HKU5-1的氨基酸一致性为94.9%～95.1%，表明它们属于蝙蝠CoV HKU5。
基于全基因组核苷酸序列和S蛋白氨基酸序列的进一步系统发育分析发现，这6种HKU5-CoV与所有之前报告的HKU5 CoV形成了不同的谱系（谱系2，以下简称HKU5-CoV-2），而后者属于谱系1（以下简称HKU5-CoV-1）（图1A-B）。蝙蝠HKU5-CoV-2141441（BtHKU5-CoV-2-441）被选为这一独特谱系的代表株进行进一步分析。相似性图谱分析表明，在嵌贝状病毒中，BtHKU5-CoV-2-441在整个基因组上与其他五种BtHKU5-CoV-2毒株的一致性最高，而BtHKU5-CoV-2-153和BtHKU5-CoV-2-155在S基因上的一致性降低（图1C）。单个蛋白质的氨基酸序列比较也显示BtHKU5-CoV-2-441与其他5种BtHKU5-CoV-2之间存在高度相似性。BtHKU5-CoV-2-441的S1蛋白与其他BtHKU5-CoV-2的氨基酸相似性为91.2%～99.2%，但与HKU5-CoV-1的相似性非常低（57.4%）（图1D）。
图1
2、蝙蝠HKU5-CoV-2利用人ACE2作为受体
为评估BtHKU5-CoV-2是否可以利用已知的4种CoV受体：人ACE2、DPP4、ACN或CEACAM 1受体，制备携带BtHKU5-CoV-2-441 S蛋白的VSV假型病毒，并将携带MERS-CoV-S、SARS-CoV-S或HKU5-CoV-1 S蛋白的假型病毒作为对照，发现经胰蛋白酶处理的过表达人ACE2的HEK293细胞能有效支持BtHKU5-CoV-2-441假型病毒的进入（图2A-D）。同样，携带MERS-CoV-S的假型病毒有效进入过表达人DPP4的HEK 293细胞，而携带SARS-CoV-S的假型病毒有效进入过表达人ACE2的HEK 293细胞。在过表达四种已知冠状病毒受体的任何一种细胞中，HKU5-CoV-1假型病毒几乎无法进入或进入非常有限。
值得注意的是，在ACE2基因敲除的Huh-7细胞中，BtHKU5-CoV-2-441病毒的进入几乎被完全阻止，但当这些细胞过表达人ACE2基因时，病毒进入能力得到恢复（图2E）。基于双分裂蛋白的融合试验发现，BtHKU5-CoV-2病毒的S蛋白能与人ACE2受体有效结合，帮助BtHKU5-CoV-2病毒进入细胞，而HKU5-CoV-1病毒的S蛋白则不能（图2F-H）。这些结果表明BtHKU5-CoV-2病毒可利用人ACE2作为其进入细胞的功能性受体。
为评估BtHKU5-CoV-2的潜在宿主范围，对来自非人灵长类动物、其他哺乳动物和鸟类的54种ACE2受体功能进行检查，发现大多数哺乳动物和鸟类ACE2受体支持BtHKU5-CoV-2-441假型病毒的有效进入，这表明BtHKU5-CoV-2的潜在宿主范围很广（图2I）。使用BtHKU5-CoV-2-441假型病毒和RBD受体结合域筛选包含57种蝙蝠ACE2受体的库，发现多种翼手目蝙蝠的ACE2受体能让BtHKU5-CoV-2-441假型病毒有效进入细胞（图2J）。与这些发现一致，BtHKU5-CoV-2-441 RBD显示出与各种蝙蝠ACE2受体的广谱结合。这些结果表明BtHKU5-CoV-2-441在ACE2受体结合方面表现出广泛的宿主倾向性。
图2
3、BtHKU5-CoV-2-441结合人ACE2受体的具体机制
通过表面等离子体共振（SPL）试验评估BtHKU5-CoV 2-441的RBD与人ACE2受体之间的结合亲和力，发现BtHKU5-CoV-2-441的RBD能有效结合人ACE2，其亲和力为6.55×106 M（图3A）。使用冷冻电镜（cryo-EM）在2.96 Å分辨率下解析BtHKU5-CoV-2-441 RBD-hACE2复合物的单颗粒结构。BtHKU5-CoV-2-441 RBD与人ACE2受体间的相互作用界面大致可以分为两个不同的区域，区域1和区域2。在区域1中，RBD上的R504、R496、A500（主链氧原子）和S524残基与人体ACE2上的H34、E37、Q96和A387等残基通过潜在的极性接触相互作用。在区域2中，RBD上的Y448、S453、R493和D537残基与人体ACE2上的Y41、N330、Q325和K353等残基通过极性接触相互作用（图3B-C）。
比较BtHKU5-CoV-2-441、NeoCoV、SARS-CoV-2、SARS-CoV和NL63的RBD与人ACE2的结合区域，发现BtHKU5-CoV-2-441和SARS-CoV、SARS-CoV-2、NL63的RBD结合位置大部分是重叠的，但和NeoCoV的结合位置重叠很少（图3D）。值得注意的是，ACE2上的N330和E329残基在所有这些病毒的结合过程中都经常参与。此外，BtHKU5-CoV-2-441结合ACE2时，会用到ACE2上的N90、T92和Q96这三个氨基酸，这是它独有的。ACE2蛋白上的A386、A387、Q388和P389这几个氨基酸会被BtHKU5-CoV-2-441和NL63病毒用到，但SARS-CoV和SARS-CoV-2病毒不会用到（图3E）。进一步的结构叠加分析显示BtHKU5-CoV-2-441在和人ACE2结合时，采用了与其他和ACE2结合的冠状病毒不同的结合模式（图3F）。
图3
4、人ACE2受体识别的决定因素
通过改变病毒RBD的结构来明确BtHKU5-CoV-2-441 RBD识别人类ACE2的决定因素。结构引导突变（SPL）实验表明，BtHKU5-CoV-2-441 RBD相互作用表面的单点突变（Y448A、R504A、S524A和D537A）导致HEK 293-hACE2细胞中病毒和ACE2的结合能力和假型病毒进入细胞的能力略有降低（图4A-B）。而BtHKU5-CoV-2-441 RBD中涉及亲水和疏水相互作用的多位点突变对与人ACE2的结合能力和假型病毒进入细胞的能力影响显著（图4A-B）。为进一步探索人ACE2上的结合决定因素，研究人员用人类ACE2上的残基替换了三种蝙蝠 ACE2中的残基，发现某些替换（如P.pip ACE2的E353K和L.bor ACE2的K30D）能显著增强ACE2和RBD的结合能力和假型病毒进入效率。
不过，有些替换（如DVK90-92NLT/N384A）虽然没有明显增强RBD结合能力，但提高了病毒进入细胞的能力（图4C-D）。研究人员还测试了人ACE2上的一些氨基酸残基替换，发现除E37K替换外，其他所有单个替换对RBD结合或假型病毒进入细胞影响不大；而双替换（如E37K/D30A和E37K/H34G）会降低RBD结合人ACE2的能力。另一些双替换（比如E329G/N330G）或多替换（比如T92I/T324G/Q325G）对RBD结合结合和进入细胞影响很小（图4E-F）。这些结果表明，E37氨基酸是BtHKU5-CoV-2-441结合人ACE2的关键残基，也说明BtHKU5-CoV-2441对人类ACE2的良好适应性。
图4
5、蝙蝠BtHKU5-CoV-2的分离和感染ACE2表达细胞
从蝙蝠肛门拭子样本中成功分离到一株BtHKU5-CoV-2菌株（ID：223023，此处命名为BtHKU5-CoV-2-023）。研究人员发现，BtHKU5-CoV-2-023感染Caco-2-hACE2（一种人类肠道细胞）细胞后，可观察到细胞病变效应（CPE）、病毒核衣壳蛋白（NP）和病毒载量增加（图5A-B）。且只有人类ACE2受体支持BtHKU5-CoV-2-023病毒在HEK293细胞中的感染，而其他几种蛋白（如人DPP4、APN或CEACAM1）则没有这种效果（图5C）。
在Huh-7细胞（一种人类肝细胞）和Caco-2细胞中，敲除ACE2后，细胞不再感染BtHKU5-CoV-2-023病毒；而过表达ACE2则恢复了细胞对BtHKU5-CoV-2-023的感染。BtHKU5-CoV-2-023病毒在Caco-2细胞中繁殖效率比在Huh-7细胞中更快（图5D-E）。此外，一种针对ACE2的抗体（h11B11）以及SARS-CoV-2和SARS-CoV病毒的RBD蛋白可以阻断BtHKU5-CoV-2-023病毒的感染，但MERS-CoV的RBD蛋白则没有这种效果（图5F-G）。当HEK293细胞表达穿山甲的ACE2蛋白时，细胞对BtHKU5-CoV-2-023病毒的感染能力显著增强；当细胞表达蝙蝠Pipistrellus kuhlii的ACE2蛋白时，感染能力稍许增强；而当细胞表达蝙蝠P.abr的ACE2蛋白时，则没有效果（图5H）。这些结果进一步证实ACE2是蝙蝠HKU5-CoV-2谱系感染的功能受体。
图5
6、蝙蝠谱系2HKU5-CoVs的细胞进入和复制的抑制
由于呼吸道和肠道是人类CoV感染的主要靶器官，对BtHKU5-CoV-2-023在人类呼吸道和肠道类中传播的能力测试发现，病毒在这些类器官中的病毒载量增加1.5至2个log单位，表明BtHKU5-CoV-2-023可能在人类呼吸道和肠道途径中传播。接下来探索了针对BtHKU5-CoV-2的潜在治疗对策，包括针对MERS-CoV RBD（m336）、针对SARS-CoV-2RBD（REGN 10933和REGN 10987）、针对CoV S2亚基（76E1和S2P6）和CoV融合抑制剂（EK1C4）的人源性单克隆抗体。虽然m336、REGN 10933和REGN 10987这三种抗体对病毒没有中和活性，但76E1、S2P6和EK1C4肽这三种物质可有效抑制BtHKU5-CoV-2-441假病毒进入（图6A-F）。后续实验发现，奈玛特韦、瑞德西韦和GC376这三种小分子药物具有显著的抗病毒效力，对CoV具有广谱抑制作用（图6G-I）。
图6
小结
这项研究揭示了蝙蝠冠状病毒BtHKU5-CoV利用人类ACE2受体入侵细胞的机制，并发现了一些对HKU5-CoV-2病毒有效的抗病毒物质，为预防和控制冠状病毒疫情提供了新的视角和思路。随着研究的深入，我们期待能够发现更多关于冠状病毒传播和致病机制的信息，以应对可能出现的公共卫生挑战。
参考文献：
Jing Chen, Wei Zhang, Yang Li, Chen Liu, Tianyi Dong, Huiyu Chen, Chunguang Wu, Jia Su, Bei Li, Wei Zhang, Ben Hu, Jingkun Jia, Cheng-Bao Ma, Yan Zhu, Xiangyang He, Ang Li, Kaiyi Pan, Haofeng Lin, Zishuo Guo, Cong Li, Libiao Zhang, Huan Yan, Peng Zhou, Wei Peng, Zheng-Li Shi. Bat-infecting merbecovirus HKU5-CoV lineage 2 can use human ACE2 as a cell entry receptor. Cell. 2025 Feb 12:S0092-8674(25)00144-8. doi:10.1016/j.cell.2025.01.042.
往期推荐
武汉大学口腔医院尚政军团队高分综述：类器官技术如何帮助我们更好地理解口腔健康
来源：培养盒守护者
