纯干货！双荧光素酶实验老失败，这些细节你get到了吗？

摘要：双荧光素酶实验是一种基于荧光素酶（Luciferase）的生物发光检测技术，原理是利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点。该实验利用两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, F-Luc）和海肾荧光素酶（Renilla Luci

双荧光素酶实验是一种基于荧光素酶（Luciferase）的生物发光检测技术，原理是利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点。该实验利用两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, F-Luc）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase, R-Luc），通过它们的活性来反映基因表达的变化和调控情况。01.两种酶的作用是什么？

02.两种酶的区别？➢底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。 ➢发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双荧光素酶报告实验中得到广泛应用。03.实验流程双荧光素酶实验因为实验材料的不同可以分为动物双荧光实验和植物双荧光实验，在基本原理上可能相似，但在具体操作、实验目的和应用方面存在一些差异。✤动物双荧光实验：通过检测这两种光的荧光强度来反映实验条件下基因的表达情况。主要用于研究基因表达调控、信号转导途径等，在药物筛选、疾病诊断和治疗等方面具有潜在应用。✤植物双荧光实验：同样基于荧光素酶的发光原理，但可能涉及更复杂的植物生物学过程，如信号转导、基因表达和蛋白质互作等。在植物育种、遗传改良、生物活性评估等方面具有广泛应用。

04.适用于什么实验需要？1、验证microRNA同mRNA靶向互作将待测基因的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，检测荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。2、验证microRNA同lncRNA/circRNA靶向互作将待测lncRNA/circRNA序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，检测荧光素酶活性。3、验证转录因子与启动子互作将待测启动子序列插入报告基因载体中，转录因子序列插入过表达载体，再将启动子报告基因质粒+转录因子过表达质粒+内参质粒PRL-TK共转入细胞，就可以用来检测转录因子对启动子的作用，启动转录越多，那报告基因的表达量就越大，荧光值越高。4、启动子结构分析将启动子区域(约2k左右)进行分段截短或突变，构建入报告基因载体，检测荧光素酶活性。5、启动子SNP分析一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。05.实验成功的关键点？★★★★★1.实验材料准备：♦合适的温度：室温下20-25℃进行操作，实验前，各个实验组分如：细胞裂解产物，底物工作液等都需要恢复到室温。♦实验成分保存：萤火虫荧光素酶底物应按需分装，避免反复冻融，并在-80℃避光保存。海肾荧光素酶底物应现配现用，以保证其活性。♦细胞状态：选择活性较高、处于指数分裂期的细胞进行转染，以提高转染效率和细胞存活率，在进行转染之前，需要培养适宜的宿主细胞至适宜的密度。

2. 实验操作过程

♦避光操作：整个实验操作过程应注意避光，以防止荧光淬灭。♦时间控制：实验过程应尽量在30分钟内完成，以保证结果的准确性。♦样品混匀：保证裂解产物与底物快速混合、混合时间一致，避免荧光素酶衰变的影响。♦细胞裂解产物处理：细胞裂解产物常温不超过6小时；-20℃一个月；-80℃半年。♦反应体系：双荧光素酶反应体系：20‌μl（细胞裂解产物）、100‌μl（萤火虫荧光素酶底物）、100‌μl（海肾荧光素酶底物），底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差。3.实验设计及结果分析♦设立对照和重复：实验中应设立阳性和阴性对照，以验证实验系统的有效性且需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参，主要是同批次样品检测值也可能出现浮动，排除多种干扰因素的影响（细胞状态、转染效率、载体质量、裂解速度、加样精准度等）。♦荧光值控制：荧光值过高可能会超出仪器的检测范围，导致无法检测到值，一般建议将荧光值控制在5-6位之间。如果荧光值过高，可以通过减少转染质粒量或适当稀释细胞裂解离心后的上清液来调整。如果荧光值过低或无荧光值，应从转染效率、启动子活性等方面进行排查。♦检测结果：检测前应检测孔板或空管的发光值，作为仪器发光背景值，样品检测发光值应该远大于仪器背景值。如果样品发光值过于接近仪器背景值，说明样品中荧光素酶过少，需要考虑转染量、转化或转染效率、裂解效率等因素。06.双荧光素酶实验有哪些优点？➢灵敏度高：比Western blot灵敏度高1000倍以上，优于GFP定量分析；➢无报告基因：报告基因来源于萤火虫，较为特异。植物、哺乳动物中无报告基因内源性表达；➢不受物质影响：荧光素酶检测不受细胞内其它物质影响；➢检测方便/范围广：检测范围广，大于7个数量级；07.金开瑞交付内容及实验结果展示

双荧光素酶实验在生命科学研究中发挥着重要的作用，为解决更多生物学难题提供了强有力的技术支撑。我司能够提供包括双荧光素酶实验、荧光素酶蛋白互补实验（LCA）、双分子荧光互补（BIFC）等技术服务，从方案流程设计到技术试验执行，从科研技术服务到成品试剂盒提供，金开瑞实验平台满足您的一切需求，期待与您一起携手合作。常见问题与解答如何判断双荧光素酶实验体系无异常，获得客观的实验结果？

可以从以下几个方面来考察实验结果的客观性：
(1) 对照的2个实验组，即实验组1与实验组2 luc表达情况应无显著差异；
(2) 转染正常，质粒或mimic确保成功转染入细胞；
(3) luc检测值在仪器检测线性范围内。

海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶相比，相对活性如何？

在氧、镁和ATP的存在下，萤火虫荧光素酶作用于萤火虫荧光素，而来源于海洋腔肠（Renilla reniformis)的荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。双报告基因技术（Dual-reporter assays），结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试。

在金开瑞做荧光素酶报告基因检测，需要提供什么？实验结果包括哪些？

您需要提供：
（1）基因序列，需提供详细的转录因子、目的基因或microRNA信息；
（2）实验细胞，如无特殊要求，金开瑞默认为使用293T细胞，则无需提供。实验结束后，金开瑞会为您提供实验流程及完整报告一份，包括实验原始数据、图片、分析结果等。

荧光素酶作为报告基因相比于荧光蛋白有哪些优势？

Luciferase的灵敏度相比于GFP提高10-100倍以上，同时具有更宽的动态范围，便于数值分析比较，不需要荧光显微镜，而且在活体实验中其荧光穿透性高于EGFP等荧光蛋白，同时由于没有内源活性、其本底信号很低。
而GFP等荧光蛋白相比于荧光素酶的优势在于可以进行失踪定位，并且其观测不需裂解细胞，方便进行适时观察。

双荧光素酶报告基因的载体比例?

根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整（萤火虫载体与海肾载体比例分别用1：10、1：20、1：50、1：100），萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。

双荧光素酶报告基因检测结果是什么？

(1)检测前应检测孔板或空管的发光值，作为仪器发光背景值，Modulus多功能检测仪的仪器背景值应小于100；
(2)样品检测发光值应该远大于仪器背景值，例如10000。如果样品发光值过于接近仪器背景值，说明样品中荧光素酶过少，需要考虑转染量、转染效率、裂解效率等因素。

双荧光素酶实验结果荧光值过高?

荧光值过高可能会超出仪器检测范围，从而检测不到值，一般读数在5-6位之间较好。荧光值过高可通过以下方式尝试解决：减少质粒转染量，细胞样品裂解后，离心取上清后检测或对裂解产物进行稀释后检测。不建议通过减少底物量来降低荧光值，需要保证底物的饱和来反映荧光素酶真实的表达水平，否则会造成检测结果出现大的偏差。

双荧光素酶报告基因实验结果荧光值过低或无荧光值?

(1)启动子活性低：a.优化细胞的培养条件，提高荧光素酶的表达量；b.更换强启动子（如SV40、CMV）。
(2)转染效率低：a.优化转染实验条件，用较易转染的质粒做阳性对照（如转染过表达荧光蛋白质粒）；b.确保转染DNA的质量，可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA质量进行鉴定；c.选择活性较高，处于指数分裂期的细胞进行转染。
(3) 样品裂解效率低a.细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好，长时间培养后，细胞可能会难裂解；b.加入的裂解液需足量，保证细胞能够充分裂解。
(4)检测过程操作不规范a. 选择合适的检测仪器，如Luminometer 发光计、多功能酶标仪或者其他能够检测生物发光的仪器都适用于该实验；b.需加入足量底物，保证底物的饱和，否则会造成检测结果出现很大偏差；c.室温反应。酶促反应对温度较为敏感，反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温（20-25℃）再使用；d.荧光素酶的半衰期一般约30min，加完底物后可立即检测，尽量在30min内完成；e. 检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光白色酶标板。黑色酶标板也可用，但因黑色会吸收光信号，可能会降低信号。
(5) 底物氧化失效a.底物避光密封保存，萤火虫荧光素酶底物-20℃保存；海肾荧光素酶底物推荐-80℃保存；b. 反应工作液建议现用现配。

来源：金开瑞生物