摘要：癌症治疗一直是医学领域的重点攻克方向，自然杀伤（NK）细胞免疫疗法近年来备受关注。NK细胞无需预先激活，就能识别并裂解肿瘤细胞和被病毒感染的细胞，在癌症免疫治疗方面极具潜力。尤其是异体NK细胞能有效治疗白血病患者，且相比自体T细胞疗法，具有降低移植物抗宿主病（
癌症治疗一直是医学领域的重点攻克方向，自然杀伤（NK）细胞免疫疗法近年来备受关注。NK细胞无需预先激活，就能识别并裂解肿瘤细胞和被病毒感染的细胞，在癌症免疫治疗方面极具潜力。尤其是异体NK细胞能有效治疗白血病患者，且相比自体T细胞疗法，具有降低移植物抗宿主病（GVHD）风险等优势，为癌症治疗带来了新的思路。
NK细胞的细胞毒性受多种激活和抑制受体调节，其中NKG2D受体可与肿瘤细胞上的NKG2D配体（NKG2DLs）结合。NKG2DLs在健康组织中通常不表达，但在肿瘤细胞中会大量表达，因此成为抗癌策略的理想靶点。
为提升NK细胞治疗癌症的效果，研究人员构建了嵌合抗原受体（CAR）来修饰免疫效应细胞。本研究将NKG2D受体的胞外域与DAP12融合构建CAR，采用RNA电穿孔技术让CAR短暂表达，以降低对正常组织的毒性风险，探索这种疗法对转移性结直肠癌的治疗效果。
该研究成果于2019年6月发表在《Molecular Therapy》杂志上，文章标题为“Adoptive Transfer of NKG2D CAR mRNA - Engineered Natural Killer Cells in Colorectal Cancer Patients”，即《NKG2D CAR mRNA工程化自然杀伤细胞过继转移治疗结直肠癌患者的研究》。
四、该研究对于mRNA癌症治疗的重要意义
开拓mRNA癌症治疗新方向：研究表明，通过RNA电穿孔技术使NK细胞表达NKG2D CAR，能显著增强其对多种实体瘤细胞系的细胞毒性，为mRNA在癌症治疗中的应用提供了新的方向。这种方法可让CAR在NK细胞上短暂表达，通过多次输注来实现抗肿瘤效果，避免了传统DNA载体可能带来的长期毒性问题，为开发更安全有效的癌症治疗手段奠定了基础。优化癌症免疫治疗策略：利用mRNA修饰NK细胞，为癌症免疫治疗提供了一种新的策略。与传统的T细胞疗法相比，NK细胞具有独特的优势，如表达多种内源性激活受体，即使肿瘤细胞上的CAR靶抗原下调，仍能发挥作用；寿命相对较短，可减少长期不良事件风险，无需引入“自杀基因”；一般不会诱导GVHD或其他免疫毒性，可实现“现成”的异体细胞免疫治疗。这一研究将mRNA技术与NK细胞免疫疗法相结合，有望优化现有癌症免疫治疗方案，提高治疗效果。推动“现成”细胞疗法发展：该研究中采用的异体细胞方法，使得大规模生产细胞治疗产品成为可能。这不仅降低了生产成本和劳动强度，还简化了细胞培养操作流程，提高了细胞产品质量的稳定性，有助于推动“现成”CAR疗法在异体细胞治疗中的应用，为更多癌症患者带来有效的治疗选择。（一）构建 CAR 载体与 CAR-NK 细胞 从人外周血单个核细胞（PBMC）的 cDNA 文库中，通过 PCR 扩增出 NKG2D 的胞外域。之后，将 NKG2D-ED 与 CD8a 铰链区、跨膜区，以及 DAP12 或 CD3ζ 信号部分融合，成功构建出 NKG2D RNA CAR 载体。同时，构建了 mGFP 对照载体，把 NKG2D 的胞外域替换为 GFP 编码序列。再通过 PCR 生成编码 NKG2D CAR 的 mRNA 模板，转录成 mRNA 分子后，采用电穿孔的方法导入 NK 细胞 。
（二）细胞培养 用于临床前研究的人外周血单个核细胞（PBMC），是从新鲜血沉棕黄层里，利用 Ficoll-Paque 通过密度梯度离心法分离出来的。NK 细胞的扩增，使用的是添加了 1% 人 AB 血清和 50 IU/mL IL-2 的 GMP 无血清 AIM V 培养基，并且要和经过 γ 射线照射的 K562 饲养细胞以 1:1 的比例共同培养。像 SKOV3-luc、Detroit562 和 HCT116-luc 这些人类实体瘤细胞系，也分别在对应的培养基中培养。
（三）实验检测 运用流式细胞术，使用 Accuri C6 细胞仪来分析细胞表面 NKG2D CAR 的表达情况。借助非放射性的 DELFIA EuTDA 细胞毒性试剂盒，检测 CAR 修饰的 NK 细胞的细胞毒活性。构建荷瘤小鼠模型时，往 NSG 小鼠腹腔注射 HCT116-luc 或 SKOV3-Luc 细胞。为研究 CAR-NK 细胞的体内抗肿瘤效果，在肿瘤细胞接种 7 天后，每周两次给荷瘤小鼠腹腔注射 1×10⁷个经 NKG2Dp RNA CAR 转染的人 NK 细胞，持续 3 周 。（四）临床试验 在广州医科大学附属第三医院伦理委员会批准后，开展了一项开放性的临床试验（NCT03415100）。招募的是化疗难治的转移性结直肠癌患者，这些患者都经过病理检查确诊，并且有影像学检查证实的转移病灶，而且至少经历过两线系统治疗失败。排除了存在急慢性感染、其他严重疾病、免疫缺陷、自身免疫性疾病等情况的患者。从患者或其单倍体相合的家庭供体采集血液样本，分离出 PBMC，在特定条件下扩增 NK 细胞并制备 NKG2Dp CAR NK 细胞。通过腹腔导管给患者输注 CAR-NK 细胞，对于部分患者，还在超声引导下经皮将细胞注射到肿瘤部位。治疗过程中，依据 CTCAE v4.0 评估不良事件的严重程度，通过 CT 和 PET 检查评估临床反应 。
实验数据
体外实验：研究人员设计了两种 NKG2D RNA CARs（NKG2Dz 和 NKG2Dp），并将其导入 NK 细胞。RNA 电穿孔技术经 EGFP mRNA 优化后，转染效率近乎 99%。转染 NKG2Dz 或 NKG2Dp 的 NK 细胞，NKG2D 表达显著增加，且 NKG2Dp CAR 的表达至少可持续 5 天。在 IFNγ ELISPOT 试验中，装备 CAR 的 NK 细胞比对照 NK 细胞产生的斑点更多（p体内实验（小鼠模型）：构建人结直肠癌 HCT116-Luc 细胞的荷瘤小鼠模型，分别用 PBS、mock NK 细胞或 NKG2Dp CAR 修饰的 NK 细胞进行治疗。结果显示，接受 NKG2Dp CAR 修饰的 NK 细胞治疗的小鼠，在 3 周治疗期内肿瘤负担减轻，但治疗停止后肿瘤出现复发。相比 PBS 组和 mock NK 组，该组小鼠的中位生存时间分别延长了 92% 和 53%，差异具有显著性（p临床试验：对 3 例化疗难治的转移性结直肠癌患者进行了 CAR-NK 细胞治疗的临床试验。从患者或其单倍体相合的家庭供体采集血液样本制备 CAR-NK 细胞，这些细胞满足释放标准且活力良好。治疗过程中，患者均未出现严重不良事件，仅观察到 1 级细胞因子释放综合征，无剂量限制毒性，也未发生移植物抗宿主病（GVHD）。对于有恶性腹水的 2 例患者（1001 和 1002），腹腔输注 CAR-NK 细胞后，腹水中 EpCAM 阳性癌细胞数量显著减少，腹水体积也明显降低。患者 1002 的腹水在治疗后由浑浊变清澈，CT 检查证实腹水减少，且两位患者的腹膜靶病灶在 CT 扫描中均显示病情稳定。患者 1003 有肝转移，经超声引导下经皮注射联合腹腔输注 CAR-NK 细胞治疗后，肝脏区域肿瘤明显缩小。多普勒超声显示肿瘤面积缩小，PET-CT 扫描显示治疗后肝脏病变的最大标准化摄取值（SUVmax）从 8.2 降至 0.14，达到完全代谢缓解。组织学检查发现，注射部位的活检样本出现坏死组织，且 NKG2DL MICA/B、Villin 和 CDX2 的表达缺失，而未注射部位的肿瘤组织则无此现象。CAR 设计的优势：含有 DAP12 信号域的 NKG2D CAR 设计为增强工程化 NK 细胞的抗肿瘤活性和特异性提供了新途径。与含有 CD3ζ 的 NKG2D CAR 相比，表达 NKG2D-DAP12 CAR 的 NK 细胞在体外具有更强的细胞毒性和更高的 IFNγ 释放水平 。mRNA 电穿孔技术的价值：采用 RNA 电穿孔技术使 CAR 在 NK 细胞上短暂表达，是一种安全可行的策略。虽然需要多次输注来实现抗肿瘤效果，但它能够有效控制 CAR 效应的持续时间和强度，且在测试新 CAR 的临床安全性方面具有优势，还能降低测试新 CAR 的成本 。CAR-NK 细胞治疗的有效性：临床研究表明，局部输注 NKG2Dp CAR 修饰的 NK 细胞对转移性结直肠癌具有明显疗效。无论是减少恶性腹水，还是缩小肝转移肿瘤病灶，都显示出这种治疗方法在临床上的潜力。尽管研究样本量较小，但为癌症免疫治疗提供了新的方向，有望成为一种有效的治疗选择，尤其是在开发安全的 “现成” CAR 疗法用于异体细胞治疗方面具有很大的吸引力 。来源：夜柒凉