同时进行双光子和三光子成像可快速诊断癌症

摘要：多光子显微镜是一种非线性光学成像技术，可实现无标记、无损伤的生物成像。多光子成像技术使用飞秒激光脉冲产生二光子和三光子过程，对于快速癌症诊断或个性化医疗具有重要意义。

便携式多光子显微镜系统利用飞秒激光脉冲创建病理质量的诊断图像

多光子显微镜是一种非线性光学成像技术，可实现无标记、无损伤的生物成像。多光子成像技术使用飞秒激光脉冲产生二光子和三光子过程，对于快速癌症诊断或个性化医疗具有重要意义。

使用传统共聚焦显微镜对生物样本进行成像需要对样本进行切片和染色，以在组织中形成对比度。然而，飞秒激光脉冲产生的非线性机制消除了标记或样本制备的需要，揭示了组织和细胞内的分子和结构细节，同时保持样本完整。

为了将这些优势引入癌症诊断，荷兰初创公司Flash Pathology正在开发一种紧凑、便携的多光子显微镜，可实时创建病理质量的图像，而无需样本固定或染色。

利用高次谐波成像快速准确地诊断癌症

Flash Pathology 的灵感来自阿姆斯特丹自由大学的Marloes Groot。在研究脑肿瘤的多光子显微镜时，Groot 意识到临床环境需要便携式显微镜。“这是一项非常强大的技术，”她说。“我当时正在研究我的大型实验室设备，我想如果我们创办一家公司，我们可以把它改造成移动设备。”

Groot 与现任 Flash Pathology 首席技术官的Frank van Mourik联手，将成像设备缩小为一个紧凑的 60 x 80 x 115 厘米系统。“Frank 制造的设备可以装在卡车里，推着它穿过走廊，而且当你插上电源时，它就会打开并产生图像——对于非线性显微镜来说，这非常特别，”她解释道。

Van Mourik 现在已经为 Flash Pathology 制造了几台多光子显微镜，其中一项主要成就是能够以极低的功率水平测量样本。“当我在实验室开始工作时，我使用的功率为 200 mW，但我们已经能够将其降低到 5 mW，”Groot 指出。“我们进行了广泛的研究，以表明我们的成像不会影响组织。”

Flash Pathology 的多光子显微镜旨在为切除的组织（如诊断活检或手术切除的组织）提供快速的现场组织学反馈。一项关键应用是肺癌诊断，临床上需要对活检进行快速术中反馈。标准组织病理学分析需要大量的样本制备，可能需要几天时间才能提供结果。

“通过肺活检，很难获得良好的诊断材料，”阿姆斯特丹自由大学的博士生Sylvia Spies解释道。“病变可能非常小，很难找到正确的位置并采集良好的样本，因此他们使用多种技术（荧光透视/CT 或超声波）来找到正确的位置并从病变处进行多次活检。尽管采用了这些技术，诊断率仍然在 70% 左右，因此 30% 的病例仍然无法得到诊断，患者可能不得不回来重复活检程序。”

另一方面，多光子成像可以快速可视化未处理的组织样本，从而实现原位诊断。最近一项使用 Flash Pathology显微镜分析肺活检的研究表明，它可以在切除后仅 6 分钟内对活检样本进行成像并提供反馈，准确率为 87% - 从而能够立即决定是否需要进一步活检。

“此外，许多临床领域现在都注重一站式服务，一次性完成诊断和治疗，”Spies 补充道。“在这里，你确实需要一种能够快速确定病变是良性还是恶性的技术。”

该显微镜出色的诊断性能部分归功于它能够使用单个超快飞秒激光同时生成四个非线性信号：二次谐波和三次谐波生成以及二光

子和三光子荧光。然后，系统使用滤波器对这些信号进行光谱分离，从而提供互补的诊断信息。例如，二次谐波生成对非中心对称结构（如胶原蛋白）敏感，而三次谐波生成仅发生在折射率不同的界面，如细胞膜或细胞核与细胞质之间的边界。

“我喜欢这项技术的原因在于，你可以看到与传统组织学相似的特征，”Spies 说道。“你可以看到胶原纤维、弹性蛋白纤维和细胞模式等结构，还可以看到细胞质、细胞核（及其大小）、核仁和纤毛等细胞细节。所有这些微小的细节都是病理学家在传统组织学中观察到的特征。”

应用飞秒激光进行 3D 深度可视化

飞秒激光在实现多光子显微镜方面发挥着关键作用。要激发双光子和三光子过程，需要在同一时间将两个或更多光子置于同一位置。使用超短激光脉冲时，发生这种情况的可能性会迅速增加。

“时间域中的脉冲越短，焦点处两个脉冲重叠的概率就越高，” VALO Innovations（隶属于HÜBNER Photonics）首席执行官Oliver Prochnow解释道。“因此，你需要强度极高、极短的激光脉冲。脉冲越短越好。”

VALO飞秒系列超快光纤激光器可输出短至 30 fs 的脉冲，这是通过利用非线性机制将光谱带宽扩展至 100 nm 以上实现的。由于光谱和脉冲持续时间本质上与傅里叶变换相关，因此宽带光谱将产生非常短的脉冲。脉冲越短，在平均功率相同的情况下，其峰值功率越高，产生多光子过程的概率就越高。

“如果将脉冲持续时间缩短五倍，双光子吸收信号将提高五倍左右，”Prochnow 说道，“相比之下，三光子过程与强度的三次方和脉冲持续时间的平方的倒数成正比。因此，如果在平均功率相同的情况下将脉冲持续时间缩短五倍，信号将提高大约 25 倍。”至

关重要的是，较短的脉冲在提供这种高峰值功率的同时，保持较低的平均功率，从而降低样品加热并最大限度地减少光漂白。

宽带光谱对于实现实用的三光子显微镜尤为重要。这里的挑战在于，传统的镱基激光器的波长约为 1030 nm，产生的三光子信号在紫外线范围内，太短而无法通过标准光学器件传输。

VALO 飞秒系列通过高达 1140 nm 的宽带光谱克服了这一问题。三倍频后产生的信号波长足够长，可以穿过标准显微镜物镜，从而使 VALO 激光器能够激发双光子和三光子过程。“我们的激光器提供了使用简单的光纤激光解决方案同时进行三光子显微镜和双光子显微镜的机会，”Prochnow 说。

该激光器包括一个集成的色散预补偿单元，用于补偿显微镜物镜的色散，并在样品上提供最短的脉冲。此外，该激光器不需要水冷，因此易于使用或集成。

面向未来临床应用

Flash Pathology 目前正在荷兰的几家医院测试其显微镜，包括阿姆斯特丹 UMC 以及 Princess Maxima 儿科肿瘤中心。“Sylvia 在他们的病理科进行了一项研究，并在一年内测量了通过的各种组织样本，”Groot 说。“我们最近还在格拉斯哥伊丽莎白女王医院安装了一台设备，用于间皮瘤研究。”

该公司目前已推出可用于研究的原型，并计划开发一套经过全面认证的多光子显微镜系统。“我们的最终目标是销售经过认证的医疗诊断设备，该设备不仅能进行活检并生成图像，而且还包含人工智能，可帮助解读图像并就疾病的性质做出诊断结论，”van Mourik 说道。

一旦在临床上全面投入使用，多光子显微镜系统将成为在支气管

镜检查或其他手术过程中进行快速原位组织分析的宝贵工具。四种非线性成像模式的独特组合，通过单个紧凑型飞秒激光器实现，可提供互补的诊断信息。“这将是一个巨大的收获，能够在手术过程中提供床边诊断，”van Mourik 总结道。