摘要：尽管大量研究表明人参的主要活性成分人参皂苷具有神经保护和抗抑郁作用，但其作用机制尚不完全清楚。本研究旨在从肠道微生物到大脑信号传导的角度阐明人参皂苷Rg1（Rg1）的抗抑郁机制，Rg1是一种口服吸收利用度低的人参皂苷。研究者通过不可预知温和应激（UMS）诱导小
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导读
尽管大量研究表明人参的主要活性成分人参皂苷具有神经保护和抗抑郁作用，但其作用机制尚不完全清楚。本研究旨在从肠道微生物到大脑信号传导的角度阐明人参皂苷Rg1（Rg1）的抗抑郁机制，Rg1是一种口服吸收利用度低的人参皂苷。研究者通过不可预知温和应激（UMS）诱导小鼠抑郁模型；通过行为和神经化学测试来评估Rg1对抑郁行为的影响和机制；进行了非靶向和靶向代谢组学研究，以鉴定Rg1抗抑郁功效背后的信号代谢产物；通过16S rRNA测序分析肠道微生物结构，并通过体外细菌培养研究与Rg1作用相关的潜在功能菌株。结果表明，Rg1改善了UMS诱导的小鼠绝望、焦虑样和社交回避行为，同时伴有下丘脑催产素分泌增加和海马神经增殖恢复。肠脑轴的代谢组学分析表明，Rg1增加了血清和脑吲哚-3-乙酸（IAA）的浓度，IAA是一种细菌代谢产物，部分归因于肠道微生物组中鼠乳杆菌的富集。口服补充IAA模拟了Rg1的抗抑郁作用，而催产素受体拮抗剂消除了Rg1和IAA的抗抑郁效果。本研究为Rg1的抗抑郁作用提供了一种新的肠脑信号机制。特别是，Rg1富集了鼠乳杆菌的丰度，这反过来又增加了大脑IAA的水平，并增强了下丘脑催产素信号。这些发现表明，通过肠脑串扰产生抗抑郁作用是一种潜在方法。
亮点：
1. 人参皂苷Rg1可增加应激小鼠血清和脑中吲哚-3-乙酸的浓度。
2. 人参皂苷Rg1部分通过催产素信号产生抗抑郁作用。
3. 吲哚-3-乙酸对小鼠慢性应激性抑郁具有保护作用。
4. 人参皂苷Rg1可能通过富集鼠乳杆菌来增加吲哚-3-乙酸。
论文ID
原名：Ginsenoside Rg1 Enriches Gut Microbial Indole-3-acetic acid to Alleviate Depression-like Behavior in Mice via Oxytocin Signaling
译名：人参皂苷Rg1增强肠道微生物吲哚-3-乙酸通过催产素信号减轻小鼠抑郁样行为
期刊：Phytomedicine
IF：6.7
发表时间：2024.10
通讯作者：郝海平&郑啸
通讯作者单位：中国药科大学
实验设计
实验结果
1. Rg1在不可预知温和应激小鼠中产生抗抑郁作用
我们之前的研究表明，Rg1（化学结构如图1A所示）缓解了慢性社交挫败应激（CSDS）诱导的抑郁小鼠模型中抑郁症状。为了进一步证实其抗抑郁作用，我们在这里探索了低剂量和高剂量Rg1（20mg/kg和40mg/kg）在已建立的UMS抑郁模型中的作用（图1B）。我们在Rg1给药14天后进行行为实验。在埋珠实验（MBT）中，与UMS组相比，低剂量和高剂量Rg1组（20mg/kg和40mg/kg）的埋珠数量显著减少（图1C）。此外，在悬尾实验（TST）和强迫游泳（FST）中，UMS的不动时间增加，Rg1有效地减少了不动时间（图1D，E）。此外，在SIT中，Rg1以剂量依赖的方式改善了UMS小鼠的社交回避行为（图1F）。这些数据共同证实，Rg1可以改善UMS小鼠的行为异常，尤其是社交回避行为。
图1 Rg1在UMS小鼠中产生抗抑郁作用。A、Rg1的化学结构式。B、实验程序的时间线示意图。C、大理石埋珠试验中埋藏的大理石数量（MBT，n=11-14）。D、小鼠在悬尾试验中的不动时间（TST，n=11-14）。E、小鼠在强迫游泳试验中的不动时间（FST，n=11-14）。F、社交互动测试中小鼠的社交能力得分（SI，n=11-14）。G、海马齿状回（DG）双皮层蛋白（DCX）的免疫荧光染色图像（红色，比例尺=100μm，n=6）。H、海马DG中DCX+细胞的平均数量（n=6）。I、小鼠海马神经营养介质的相对mRNA表达（n=8）。J、小鼠海马突触标志物的相对mRNA表达（n=8）。数据以平均值±SEM表示；*P
神经发生障碍是抑郁症的典型标志。一致性方面，我们进一步发现UMS小鼠海马齿状回（DG）中双皮层蛋白（DCX）阳性细胞的数量显著减少，Rg1显著逆转了这一变化（图1G，H）。因此，我们进一步探讨了Rg1对海马神经营养因子的影响。我们发现UMS模型降低了Gdnf和Ngf的表达，但Rg1处理对这两个因素没有影响（图1I）。我们还比较了海马突触蛋白的mRNA表达。UMS模型降低了GluA2和CamkIIα的表达，而Rg1有效地逆转了CamkIIβ的减少（图1J）。综上所述，这些结果表明，Rg1对UMS小鼠的抗抑郁作用伴随着海马神经可塑性的改善。qPCR分析引物入表2所示。
表2 qPCR分析引物
2. Rg1选择性地增加血清和脑组织中的IAA水平
为了了解Rg1如何影响突触可塑性和行为，尽管其在大脑中的分布较差，我们对血清进行了非靶向代谢组学分析，以寻找潜在的肠脑信号。我们发现UMS和Rg1处理组之间的多种代谢物存在差异（图2A）。通路富集分析表明，Rg1引发了代谢途径的转变，主要与不饱和脂肪酸合成和色氨酸（Trp）代谢有关（图2B）。TRP由宿主和肠道微生物群共同代谢，产生多种信号代谢物，这些代谢物已被证明是肠脑串扰和行为的多功能调节因子。为了进一步考虑人参皂苷与肠道微生物组的相互作用，我们通过一种经过验证的方法对色氨酸代谢途径进行了靶向分析。我们发现，在USM小鼠的血清中，细菌衍生的吲哚代谢物，如IAA、IAld（吲哚-3-甲醛）、ILA（吲哚-3-乳酸）、IA（吲哚-3-丙烯酸）、IPA（吲哚-3-丙酸）显著降低。Rg1持续增加血清和海马中的IAA水平，下丘脑也有增加的趋势（图2C-I），这表明IAA水平的调节可能是Rg1作用机制的一个关键方面。母离子和子离子的定量分析结果见表1。
图2 Rg1通过细菌色氨酸代谢途径增加吲哚-3-乙酸（IAA）。A、UMS和Rg1处理组血清代谢物的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）分析。B、根据非靶向代谢组学，前25条富集途径的列表。C-I，血清（C，D）、回肠（E）、结肠（F）、海马（G）、下丘脑（H）和前额叶皮层（I）中色氨酸途径代谢物的浓度（n=10-12）。数据以平均值±SEM表示；*P
表1 色氨酸-吲哚途径代谢物母离子和子离子的LC-MS/MS检测参数
3. Rg1可能通过富集鼠乳杆菌增加IAA产量
微生物IAA水平的增加与之前关于Rg1和肠道微生物代谢之间密切相互作用的报道非常一致。众所周知，IAA是由梭菌、乳杆菌和拟杆菌属的细菌产生的。然而，Rg1对微生物IAA调节的详细机制尚未阐明。为了回答这个问题，首先我们试图确定UMS小鼠中Rg1调节的关键差异物种。基于16S rRNA测序和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），我们发现对照组、UMS组和Rg1治疗组的微生物谱存在单独的聚类（图3A-B）。具体来说，在UMS暴露后，拟杆菌被下调，而厚壁菌门、放线菌门和疣状菌门被富集（图3C）。此外，在属水平上，UMS建模后，Allobaculum和Muribaculaceae下调，双歧杆菌上调（图3D）。Rg1逆转了这些变化。我们使用基于决策树的随机森林方法进行的进一步分析表明，鼠乳杆菌是排名靠前的菌株之一，这可能是一种有助于IAA生产的潜在功能细菌（图3E，F）。
图3 鼠乳杆菌可能参与Rg1的抗抑郁作用。A、肠道微生物组的α多样性（Shannon指数）。B、肠道微生物组β多样性的PLS-DA分析。（n=6）。C、门水平上代表性分类群的相对丰度。D、属水平上代表性分类群的相对丰度。E、线性判别分析（LDA）与效应大小测量相结合，为每个组识别判别分类群。仅显示LDA评分大于2的分类群。F、通过对不同群体中的相对丰度进行随机森林回归，确定了15个最具鉴别性的物种。G、UMS建模结束时，不同组中鼠乳杆菌的相对丰度（n=6）。差异通过Mann-Whitney U检验进行评估。H、Rg1预处理的小鼠粪便中鼠乳杆菌的相对丰度（n=12）。I、Rg1处理24小时后对鼠乳杆菌生长的影响（n=3）。J、鼠乳杆菌从Trp转化为IAA的相对浓度。数据以平均值±SEM表示；*P
事实上，我们发现UMS小鼠中鼠乳杆菌的丰度显著降低，但Rg1在UMS小鼠或对照小鼠中显著增加（图3G，H）。为了探究Rg1是否能直接影响鼠乳杆菌的生长，我们将Rg1应用于鼠乳杆菌的培养基中。Rg1对鼠乳杆菌的生长显示出促进作用（图3I），这可能部分解释了为什么它可以在UMS小鼠中富集鼠乳杆菌。为了探索鼠乳杆菌是否也可以将Trp代谢为IAA，我们检测了添加Trp的培养基中IAA的产生。我们发现，在6小时的孵育后，IAA被有效地产生（图3J），这进一步表明鼠乳杆菌可能是一种介导Rg1抗抑郁作用的功能菌株。
4.催产素信号介导Rg1的抗抑郁作用
乳杆菌物种之前已被证明可以增加大脑中的催产素（OXT）水平。OXT主要由下丘脑神经元产生，众所周知，它通过投射到海马等关键区域来促进神经发生和社会行为。因此，我们试图了解OXT信号是否参与Rg1的抗抑郁作用。UMS小鼠室旁核（PVN）中的OXT+细胞数量显著减少，而高剂量Rg1显著恢复了该区域的OXT＋细胞（图4A，B）。这一发现表明，Rg1可能通过影响UMS小鼠下丘脑-海马OXT信号发挥抗抑郁作用。
为了探索这一作用的功能相关性，通过施用可渗透血脑屏障的OXTR抑制剂L-368899阻断了OXT信号传导（图4C）。在OFT中，L-368899逆转了高剂量Rg1在UMS小鼠中诱导的中心进入和停留时间的增加（图4D，E）。与Rg1组相比，OXTR抑制剂处理后埋藏的珠子数量也显著增加（图4F），Rg1对小鼠社交回避行为的缓解作用同样被消除（图4G）。在TST和FST中，OXTR抑制剂也消除了Rg1对UMS小鼠静止时间的保护作用（图4H，I）。综上所述，这些结果表明Rg1的抗抑郁机制在功能上依赖于OXT信号传导。
图4 下丘脑中的催产素信号传导介导Rg1的抗抑郁作用。A、室旁核中催产素（OXT）的免疫荧光染色图像（PVN，红色，比例尺=100μm，n=3）。B、PVN中OXT+细胞的平均数量（n=3）。C、测试催产素信号依赖性的实验程序示意图。（D、E）OFT中心区域的进入次数和停留时间（n=11-13）。F、MBT中埋藏的大理石数量（n=11-13）。G、SI中的社交能力得分（n=11-13）。H、TST中的不动时间（n=11-13）。I、FST中的不动时间（n=11-13）。数据以平均值±SEM表示；*P
5. IAA对UMS小鼠产生抗抑郁作用
我们想知道IAA是否可以作为Rg1的信使来使其具有抗抑郁作用。通过生物分布测定，我们发现口服IAA后，IAA在小鼠海马和下丘脑等脑区分布良好（图5A），这增强了Rg1调节的微生物IAA可能通过进入大脑影响行为的可能性。为了直接探索这一点，我们给UMS小鼠服用IAA，并检查了行为结果（图5B）。正如预期的那样，IAA显著增加了UMS小鼠在OFT中心的进入次数和停留时间（图5C，D）。在MBT中，与UMS组相比，IAA处理组的埋藏珠子数量显著减少（图5E）。此外，IAA显著改善了UMS小鼠的社交回避行为（图5F），并缩短了小鼠在TST（图5G）和FST（图5H）中的不动时间。总的来说，这些数据表明IAA对小鼠具有直接的抗抑郁作用。
图5 IAA对UMS小鼠具有抗抑郁作用。A、灌胃或腹腔给药后小鼠血清和组织中IAA的浓度-时间曲线（n=5）。B、探索IAA抗抑郁作用的实验设计示意图。C、D OFT中心区域的进入次数和停留时间（n=12-13）。E、MBT中埋藏的大理石数量（n=12-13）。F、SI中的社交能力得分（n=12-13）。G、TST中的不动时间（n=12-13）。H、FST中的不动时间（n=12-13）。数据以平均值±SEM表示；*P
6. IAA通过催产素信号发挥抗抑郁作用
我们进一步探究了催产素信号是否对IAA的作用不可或缺；为此，在施用IAA之前给药OXTR抑制剂L-368,899（图6A）。我们发现，与Rg1的作用相似，IAA对大脑中OXT阳性神经元具有保护作用，包括PVN中OXT表达的显著恢复（图6B-C），海马中DCX阳性细胞数量的显著增加（图6D-E）。L-368899逆转了IAA对OXT信号传导的保护作用，也阻断了IAA对OFT（图6F，G）、SIT（图6H）、TST（图6I）和FST（图6E）中抑郁样行为的改善作用。综上所述，这些发现表明下丘脑-海马OXT信号传导在IAA的抗抑郁作用中起着重要作用。
图6 IAA以催产素受体依赖的方式产生抗抑郁作用。A、实验设计示意图。B、PVN中OXT表达的免疫荧光图像（红色，比例尺=100μm，n=3）。C、PVN中OXT+细胞的平均数量（n=3）。D、DG中DCX表达的免疫荧光图像（红色，比例尺=100μm，n=6）。E、DG中DCX+细胞的平均数量（n=6）。F、G OFT中心区域的进入次数和停留时间（n=9-12）。H、SI中的社交能力得分（n=9-12）。I、TST中的不动时间（n=9-12）。J、FST中的不动时间。（n=9-12）。数据以平均值±SEM表示；*P
识别新的信号机制和靶点已成为抗抑郁治疗的迫切需要。肠道微生物组在抑郁样行为中起着重要作用，尽管介导这种联系的信号机制及其在抗抑郁疗效中的作用尚不清楚。在这项研究中，从微生物组-药物-宿主相互作用的角度来看，我们发现Rg1通过增加血清和脑组织中的微生物色氨酸代谢产物IAA对UMS小鼠发挥抗抑郁作用，这增强了下丘脑催产素的分泌，提高了海马区的神经发生能力。这些发现为人参皂苷的抗抑郁作用提供了新的机制见解，更重要的是，确定了一种有可能开发成抗抑郁药物的活性细菌代谢物（图7）。
图7 显示Rg1在小鼠中的抗抑郁机制的示意图。Rg1重塑了肠道微生物结构，增加了慢性应激小鼠体内吲哚-3-乙酸（IAA）的浓度，IAA进入大脑以增强下丘脑催产素信号传导并挽救海马神经发生。PVN，室旁核；HPC，海马体。
先前的研究表明，Rg1可以在患有CUMS或CSDS的小鼠中发挥抗抑郁作用。根据这些发现，我们发现Rg1能够改善UMS小鼠的抑郁样行为，同时改善海马神经可塑性。尽管具有明确的抗抑郁活性，但药代动力学研究表明，大多数人参皂苷类似物在体循环中的暴露量较低，特别是在大脑中的分布极低（甚至不可分配）。肠脑轴的存在为大脑和行为调节提供了间接途径。因此，我们试图了解Rg1如何从外周系统发挥“远程”抗抑郁作用。通过对肠脑轴上不同位点的非靶向代谢组学分析，我们发现Rg1引发了通常涉及色氨酸代谢的代谢途径的变化。特别是，我们发现Rg1在外周和大脑中持续增加IAA，这表明IAA在抗抑郁作用中起着密切作用。众所周知，色氨酸可以被色氨酸-2-单加氧酶（TMO）分解为吲哚-3-乙酰胺（IAM），这是IAA的前体；IAA进一步转化为3-甲基吲哚或吲哚-3-甲醛（IAld），作为色氨酸吲哚微生物代谢的最终产物。然而，我们没有观察到其他吲哚代谢物如IAld和IAM的类似变化模式，这表明Rg1调节IAA的特定细菌来源。
通过细菌测序，我们证实了UMS建模或Rg1干预诱导的盲肠微生物组的结构重塑。Rg1的给药增加了UMS小鼠中L.murinus的丰度，体外培养实验结果表明，Rg1直接促进了L.murinu的生长。根据L.murinus可以产生吲哚的报道，我们通过体外培养验证了L.murinu可以在体外直接将Trp转化为IAA。总之，这些数据表明，Rg1可能通过增加L.murinus的丰度和IAA水平来发挥抗抑郁作用。然而，未来的研究有必要探索Rg1的抗抑郁作用是否依赖于L.murinus IAA信号，可使用缺乏IAA产生的工程菌株。此外，确定对L.murinus IAA信号的调节是否存在任何剂量依赖性效应将也是有必要的，这将为Rg1的给药方案提供更多的理论依据。
OXT在社会行为中起着重要作用，这归因于PVN向边缘系统中各种大脑区域的投射。有报道称，血清OXT水平与MDD患者的抑郁程度呈负相关。OXT还可以通过促进海马的增殖和分化，增加树突棘的密度和突触可塑性来改善应激诱导的抑郁样行为。特别是，L.murinus已被证明可以增强大脑中的催产素信号，从而改善自闭症谱系障碍小鼠模型的社会行为。因此，我们探讨了Rg1和IAA对催产素途径的影响，OXTR拮抗剂的结果表明，OXT信号确实介导了Rg1与IAA的抗抑郁作用。值得注意的是，我们的研究结果表明，抗抑郁作用可能归因于下丘脑-海马OXT信号传导和海马神经元的增殖能力。然而，未来专门针对这种神经回路的光遗传学或化学遗传学操作有望阐明这一点。此外，IAA如何抑制PVN的OXT信号是另一个悬而未决的问题。
IAA以前主要以其抗炎作用而闻名，其部分由树突状细胞和巨噬细胞等免疫细胞上的芳烃受体（AHR）介导。在患有炎症性肠病的个体中，IAA-AHR轴诱导的IL-22刺激上皮再生并减少炎症，在调节肠道炎症中起着关键作用。最近，IAA也被报道可以调节IL-35的产生并影响肠道免疫屏障。然而，IAA对抑郁样行为的影响及其机制尚未见报道。我们的药代动力学特征表明，口服IAA后，IAA在大脑中的分布很快，提示IAA可能通过特异性转运蛋白透过血脑屏障。通过对UMS小鼠外周给药IAA，我们发现IAA改善了UMS小鼠的抑郁样行为，并且与Rg1的作用相似，IAA对大脑中的OXT信号具有保护作用。IAA和其他吲哚代谢物已被证明参与宿主免疫反应、神经传递和其他过程。我们的研究结果进一步表明，IAA可以作为催产素分泌的内源性促进剂，因此可以开发用于治疗抑郁症。基于微生物群肠脑轴机制在精神疾病发展中的贡献，并考虑到微生物代谢物是肠脑轴中的重要信号分子，我们关于IAA的研究结果增加了信号代谢物数量，揭示口服吸收低的植物化学物质与脑活动调控之间的潜在关联。
传统上认为，神经递质的变化是抑郁症相关行为症状的主要驱动力，因为它会影响大脑的神经功能，并且有许多药物作用于神经递质以发挥抗抑郁作用。这些神经精神疾病的治疗方式主要表现为直接靶向大脑。我们在研究中发现Rg1作用于L.murinus-IAA信号并发挥远程抗抑郁作用，这与之前认为Rg1直接影响中枢神经系统以发挥抗抑郁作用的观点明显不同。它为促进抑郁状态下微生物群-药物-脑相互作用的病理生理机制研究提供了新的切入点，丰富了精神疾病外周干预策略的科学内涵。然而，我们的研究也有几个未解决的问题。我们发现IAA的抗抑郁机制涉及OXT，但IAA如何调节内源性催产素信号和下游神经回路仍有待澄清。研究IAA作用于催产素信号传导的机制不仅将扩大我们对抑郁症的理解，还可能从基于靶点/机制的先导优化中带来新的治疗方法。我们研究的另一个有问题是Rg1治疗如何丰富UMS小鼠肠道中的L.murinus。我们认为，这可以从黏膜环境变化的角度进一步探讨，包括营养可用性、黏蛋白产生和菌群相互作用。此外，从临床转化的角度来看，我们有必要了解Rg1在调节IAA介导的抗抑郁疗效方面的剂量依赖性作用，以及IAA的潜在剂量-效应关系。
结论
总之，我们的工作为Rg1的抗抑郁作用提供了一种新的肠脑轴机制。特别是，Rg1通过增加肠道L.murinus的富集来提高抑郁小鼠海马神经元的增殖能力，这反过来又提高了大脑中的IAA水平，并增强了参与神经发生的下丘脑催产素信号。我们的工作还提升了目前对连接微生物组和行为的代谢信号理解，为通过肠脑串扰产生抗抑郁作用提供了潜在的途径。
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944711324008432?via=ihub
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来源：健康之光芒