摘要：近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由中国农业科学院郑州果树研究所鲁振华课题组及其合作团队撰写的“A telomere‐to‐telomere gap‐free assembly integrating multi‐omi
近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由中国农业科学院郑州果树研究所鲁振华课题组及其合作团队撰写的“A telomere‐to‐telomere gap‐free assembly integrating multi‐omics uncovers the genetic mechanism of fruit quality and important agronomic trait associations in pomegranate”论文。该研究工作首先组装了首个石榴端粒到端粒（T2T）参考基因组图，发现石榴非典型端粒重复单元为TTTTAGGG。进一步基于146份种质进行全基因组关联分析（GWAS），共鉴定出15个重要农艺性状的相关联位点16个，基于基因敲除、基因过表达和生化实验等结果表明1号染色体37.2 kb的染色体易位打断了PgANS基因编码序列，导致叶片、花朵和果实（果皮和籽粒）花青素缺失；PgANR基因启动子区域特有的重复序列扩增影响了其表达量进而导致紫色果皮的形成；石榴籽粒硬度由内种皮厚度决定，位于PgNST3基因编码区第166 bp的非同义SNP（G→A）导致PgNST3蛋白发生E56K突变，影响了其与PgMYB46启动子的结合能力，最终导致软籽石榴内种皮变薄。该研究团队报道的无间隙基因组、重要经济性状关键基因及基于CRISPR-Cas9的基因敲除体系为石榴精准育种提供了重要资源。
多年生作物童期长，导致其遗传改良成本高、周期长。以分子标记辅助选择和基因编辑技术辅助的分子育种体系已成为提高育种效率的关键策略（Li et al.，2024）。石榴（Punica granatum L.）原产于伊朗及周边地区（Holland et al.，2009），栽培范围广，其营养、药用、经济和观赏价值使其被誉为‘超级水果’（Sharma et al.，2017）。目前石榴育种主要依赖常规杂交育种，三个主要因素限制了其分子育种工作的开展，包括：（1）缺乏完整的基因组图谱；（2）少数农艺性状相关基因被鉴定（Harel-Beja et al.，2015；Trainin et al.，2021）；（3）石榴基因编辑应用未见报道。为克服上述限制因素，中国农业科学院郑州果树研究所鲁振华课题组及其合作团队组装了石榴T2T基因组图谱，进而通过GWAS鉴定出15个重要农艺性状的相关联位点16个，其中对石榴果皮颜色和籽粒硬度等重要品质性状形成的遗传机制进行深入解析，同时建立了石榴基于CRISPR-Cas9的基因敲除体系，开启了基因编辑技术在石榴中的应用，为石榴分子育种体系的建立奠定了良好的基础。全文主要研究结果如下：
1. 石榴T2T基因组组装、验证和注释
研究团队首先利用PacBio HiFi、HiC和ONT数据，结合多种组装策略，完成了T2T-Moshiliu基因组图谱，并通过PCR、CEGMA和BUSCO评估等对组装结果进行验证。该研究组装的Moshiliu参考基因组包含8条染色体，总长度为366,710,298 bp。预测编码蛋白基因32,158个，解析了全部端粒和着丝粒序列信息（图1 a），填补了Tunisia参考基因组所有的188个缺口（图1 a）。这是石榴上首次报道的T2T参考基因组。
2. 非典型端粒基序可能影响千屈菜科物种的进化
端粒在基因组稳定性中起关键作用（van Steensel et al.，1997；Peska et al.，2020）。即使端粒基序的微小改变也可能破坏序列特异性端粒蛋白的结合，从而影响进化轨迹（Peska et al.，2020）。通常，端粒重复单元在植物物种中高度保守，保守的植物端粒序列为TTTAGGG（Richards et al.，1988）。该研究基于T2T参考基因组组装和荧光原位杂交结果，在石榴中发现了非典型端粒单元TTTTAGGG（图1 b-d），目前仅绿藻Chlamydomonas reinhardtii（Petracek et al.，1990）和Yamagishiella unicocca（Lyčka et al.，2024）、原生生物寄生虫Theileria annulata（Hall et al.，1990）和根肿病菌Plasmodiophora Brassicae（Javed et al.，2024）被报道具有此类端粒单元，而石榴是唯一具有该序列的被子植物。进一步分析发现，与已报道的其他桃金娘目植物存在保守的植物端粒基序（TTTAGGG）特征不同，千屈菜科植物石榴、大花紫薇、耳叶水苋菜和杯萼海桑中均表现为非典型的端粒基序特征（图1 e），以上结果表明非典型端粒基序可能在千屈菜科物种进化中发挥重要作用。
图 1 Moshiliu T2T基因组图及非典型端粒基序分析
3. 基于GWAS鉴定出与15个重要农艺性状相关的16个位点
通过全基因组关联分析（GWAS）对146份石榴种质资源的15个农艺性状进行了研究，其中包括10个果实品质性状（籽粒硬度、籽粒颜色、果皮颜色、总酸含量、萼片形态、百粒重、可溶性固形物总量、萼片长度、果皮硬度、果皮厚度）和5个其它形态性状（嫩叶颜色、萼片颜色、花瓣颜色、花型、茎刺）。共鉴定出与15个农艺性状相关的16个候选位点。其中，与籽粒硬度（Chr01:87226201）以及白色果皮相关联的候选SNP位点（Chr01:84728426）分别解释了100%和86.67%的表型变异。与白色果皮（Chr01:84769164-84829185）和黑色果皮（Chr05:32920129-32921186）相关的候选结构变异（SVs）分别解释了86.67%和100%的表型变异。其余12个与另外9个农艺性状相关的位点，可解释17.84%-91.72%的表型变异。
籽粒大小影响果实品质，研究团队对连续三年的石榴籽粒百粒重数据进行GWAS分析，将控制石榴籽粒大小的关键基因定位于Chr06:3.68-3.88 Mb的候选区域，该区域包含16个候选基因，其中4个基因（Pgr06G003620.1、Pgr06G003650.1、Pgr06G003670.1、Pgr06G003690.1）注释为细胞色素P450 87A3同源基因，已有研究表明该家族基因作为植物生长素响应因子可调控水稻生长发育（Chaban et al.，2004）。此外，石榴花型与茎刺存在紧密关联，表现为重瓣花种质均无茎刺。研究团队发现Chr05:4317126出SNP位点变异与石榴重瓣性状显著关联，可解释91.72%的表型变异。同时将控制石榴果皮硬度（果实贮藏的关键性状指标）的关键基因定位于Chr01:79.13-79.17 Mb的候选区间。
4. 37.2 kb易位导致石榴花色苷缺失
果皮颜色显著影响果实的品质和商业价值，由花青素生物合成和运输决定（图2 a）。前期Ben-Simhon等（2015）研究结果表明PgANS表达缺失引起石榴花青素缺失，受技术限制或基因组区域复杂性影响，他们将PgANS表达缺失的原因归因于其编码区可能存在一段插入，但未能扩增出插入片段。本研究基于GWAS关联分析、基因序列和表达分析，发现一个37.2 kb的易位（而非插入）破坏了PgANS编码序列，导致白皮石榴中该基因表达显著降低（图2 b-g）。为验证PgANS在花青素缺失中的作用，研究者们首次在石榴中建立了CRISPR-Cas9介导的基因敲除系统，并证实了PgANS在花青素合成中的功能（图2 h, i）。此外，研究结果表明紫皮石榴中PgANR启动子的重复扩增导致其表达降低（图2 j-l），限制了花青素向原花青素的转化，从而形成紫皮表型。
图 2 PgANS染色体易位导致石榴植株花青素缺失
图 3 PgNST3调控石榴籽粒硬度
5. PgNST3基因编码区E56K突变特异影响石榴籽粒硬度
石榴果实食用部位为种子，籽粒硬度是决定石榴果实口感和消费者认可度重要品质指标。软籽石榴具有籽软可食、食之无渣的特点。该研究发现内种皮及其次生细胞壁厚度是石榴籽粒硬度的主要决定因素（图3 a-c），遗传分析结果表明软籽性状可能由单个隐性等位基因控制。基于GWAS分析，研究团队定位克隆到一个与石榴籽粒硬度显著相关的主效位点，命名为PgNST3（与拟南芥中调控植物次生壁生物合成的NAC Secondary Wall Thickening-Promoting Factor 3基因同源）（图3 d,e）, 位于PgNST3编码区166 bp处的非同义SNP（G→A）导致PgNST3蛋白发生E56K突变，与软籽性状紧密关联（图3 f），E56K突变导致两种基因型，PgNST3G（硬籽）、PgNST3A（软籽）。PgNST3基因表达与石榴籽粒硬度显著相关（图3 g-i）。
在GWAS分析结果的基础上，研究团队通过番茄遗传转化验证了PgNST3调控籽粒硬度的功能，35S::PgNST3A可显著降低番茄籽粒硬度和种子纵径大小（图4 a-e）。为了阐明PgNST3调控石榴籽粒硬度的机制，研究团队基于基因表达分析及双荧光素酶实验结果筛选了PgNST3的潜在下游调控转录因子PgMYB46。双荧光素酶和EMSA结果均表明，E56K突变导致PgNST3A丧失对PgMYB46启动子的反式激活能力（图4 f-h）。以上结果表明，PgNST3编码区E56K突变影响其与下游转录因子PgMYB46启动子的结合（图4 i），进而影响石榴籽粒硬度。
这项研究组装的石榴T2T基因组图谱；挖掘的控制石榴重要品质性状果皮颜色和籽粒硬度形成的基因PgANS、PgANR和PgNST3；建立的石榴基于CRISPR-Cas9的基因敲除体系不仅为石榴分子育种体系的建立奠定了良好的基础，同时为植物果皮花青素合成积累和内种皮次生细胞壁发育的分子机制解析提供新的见解。
陈利娜助理研究员为论文第一作者，鲁振华研究员为通讯作者，在读博士研究生王豪和朱娟丽、刘锐涛助理研究员和李好先副研究员等参与了相关工作。北京大学现代农业研究院张华伟研究员为石榴基因编辑提供了重要的技术支持，西南大学郭启高教授等为石榴核型分析提供了技术支持。该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划、河南省自然科学基金、中国农业科学院科技创新工程等项目资助。
论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.70107
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来源：老孙说科学
