Cell丨Integrator缺失诱导整合应激反应

摘要：Integrator（INT）是一种负责在转录起始位点附近终止RNA聚合酶II（RNAPII）转录的蛋白质复合物，可以抑制应激响应基因的转录。INT亚基的突变与多种人类疾病相关，包括癌症、纤毛病和神经发育障碍，但INT突变如何导致疾病尚不清楚。

撰文 I 一只鱼

Integrator（INT）是一种负责在转录起始位点附近终止RNA聚合酶II（RNAPII）转录的蛋白质复合物，可以抑制应激响应基因的转录。INT亚基的突变与多种人类疾病相关，包括癌症、纤毛病和神经发育障碍，但INT突变如何导致疾病尚不清楚。

近日，来自美国哈佛医学院的Karen Adelman研究团队在Cell上发表题为Integrator loss leads to dsRNA formation that triggers the integrated stress response的文章，发现在人类细胞中，INT的功能丧失会诱导整合应激反应（ISR）。INT敲除导致短基因（如ISR转录因子ATF3）的上调。此外，INT敲除后逃逸进入基因体区的未成熟RNAPII容易发生过早终止，产生含有保留内含子的未完成前体mRNA。这些保留的内含子中的逆转录元件形成双链RNA（dsRNA），被蛋白激酶R（PKR）识别，进而驱动ATF4的激活和持续的ISR。

INTS1是INT复合物在RNAPII暂停延伸复合物上的主要结合位点，研究人员首先利用CRISPR-Cas9构建了INTS1AID细胞系，用生长素处理可以敲降INTS1的蛋白水平，发现INTS1敲降会导致所有INT亚基从SPT5/RNAPII复合物中解离。为了研究INT缺失对转录的直接影响，他们在生长素处理4小时后进行了瞬时转录组分析，发现在上调的基因中炎症和应激反应相关基因富集。INTS1缺失激活的基因长度显著短于未受影响基因，下调基因则更长，而信号响应基因通常长度较短，这可能有利于其快速激活。接下来他们分析了INTS1缺失4小时和12小时后的转录组，检测到5个具有不同时序表达特征的基因簇，簇2-4显著富集于促炎信号、DNA损伤及其他应激反应，值得注意的是，簇3基因在生长素处理4小时后仅轻微上调，但在12小时后激活程度显著增强，这些基因与ATF3的表达呈最强关联性。ATF3是整合应激反应（ISR）的核心调控因子，他们发现INTS1敲降细胞中ATF3和ATF4蛋白水平迅速升高并维持16小时，ISR通路基因表达显著上调，eIF2α磷酸化，蛋白质合成速率显著降低，应激颗粒形成。因此，破坏INT复合物可以激活ISR。

ISR可被多种应激信号激活，包括未折叠蛋白、营养缺乏和双链RNA（dsRNA），为了研究ISR激活的机制，他们对INTS1缺失12小时的细胞进行RNA-seq基因集富集分析，排名最前的免疫响应通路涉及细胞对dsRNA的反应，他们推测INTS1缺失可能导致异常转录本合成，进而产生dsRNA。通过免疫荧光检测，他们发现敲降INTS1的4小时后细胞质内dsRNA信号显著增加。细胞质中的dsRNA被PKR识别后，会诱发其自磷酸化并磷酸化eIF2α，激活ISR，他们发现INTS1缺失后0-16小时磷酸化PKR水平迅速升高并持续维持。接下来他们敲除了PKR，发现可以抑制ISR的激活，因此，在INT缺失细胞中ISR的激活依赖于PKR。为了研究dsRNA的来源，他们利用结合dsRNA的J2抗体进行RIP-seq，发现超过80%的J2与PKR RIP-seq峰与注释TE区域重叠，其中短散在核元件（SINE）富集尤为显著。进一步分析发现INTS1缺失导致RNAPII延伸缺陷，在长基因中尤为显著，这种缺陷促进转录提前终止，释放保留内含子序列的前体mRNA，进而形成dsRNA。

在神经系统疾病中描述最多的INT突变是INTS8，于是他们构建了INTS8AID细胞系，首先验证了INTS8敲降可以破坏INT功能并引起细胞质dsRNA累积，诱导ATF4翻译、eIF2α磷酸化和PKR自磷酸化，激活ISR。此外，在两例INTS8杂合突变患者的成纤维细胞中也发现ISR激活，并且将患者成纤维细胞重编程为iPSC后，通过CRISPR-Cas9进行基因校正可以逆转ISR的异常激活。