摘要：做Western Blot（WB）实验时，是不是经常遇到条带和理论大小对不上的情况？😩 别急，今天就来给大家揭秘，WB条带异常的那些“坑”，快搬好小板凳，认真听讲啦！
做Western Blot（WB）实验时，是不是经常遇到条带和理论大小对不上的情况？😩 别急，今天就来给大家揭秘，WB条带异常的那些“坑”，快搬好小板凳，认真听讲啦！
🌟 蛋白质本身特性：修饰和降解是“罪魁祸首”
1️⃣ 翻译后修饰
蛋白质合成后，可能会经历各种修饰，比如磷酸化、糖基化、泛素化等。这些修饰会改变蛋白质的分子量。比如，糖基化会增加蛋白质的分子量，让条带位置比理论值低。磷酸化虽然单个基团影响小，但多个磷酸化位点累积起来，也会让条带位置变低。
2️⃣ 蛋白质降解
蛋白质在提取、保存和电泳过程中，可能会被蛋白酶降解。蛋白酶可能来自样本本身、杂质或者细胞破碎时释放的酶。如果蛋白质降解，就会出现比理论分子量小的片段。比如，提取胰腺组织时，如果没有加蛋白酶抑制剂，蛋白质很容易被降解，导致WB结果出现多个条带。
3️⃣ 蛋白质聚合或二聚体形成
有些蛋白质会形成聚合体或二聚体。比如，膜蛋白在去垢剂存在时，可能会通过疏水相互作用或二硫键连接形成二聚体。这种二聚体的分子量是单体的两倍，条带位置会比理论值高。
🌟 实验操作相关因素：细节决定成败
1️⃣ 样本制备问题
裂解不充分：如果细胞没有完全裂解，蛋白质可能没有完全释放出来，条带就会模糊或位置异常。比如，处理难裂解的细胞时，如果没有用合适的裂解缓冲液，就会出现这个问题。蛋白定量不准确：蛋白定量方法不准确，会导致上样量过多或过少。上样量过多，条带太浓；上样量过少，条带太淡或位置偏移。2️⃣ 电泳过程中的问题
凝胶浓度不合适：不同分子量的蛋白质需要不同浓度的凝胶。如果凝胶浓度过高或过低，条带就会弥散或位置异常。电泳时间或电压不当：电泳时间过长或过短，电压过高或过低，都会影响条带的清晰度和位置。一般来说，电泳电压和时间需要根据凝胶浓度和蛋白质分子量进行优化。3️⃣ 转膜过程中的问题
转膜条件不当：转膜电压过高或过低，转膜时间过长或过短，都会影响转膜效果。如果转膜缓冲液中的甲醇浓度过高或过低，也会影响蛋白质与膜的结合。转膜不均匀：如果电场不均匀或膜与凝胶之间有气泡，蛋白质转膜就会不均匀，条带位置也会不一致。🌟 抗体相关因素：选对抗体很重要
1️⃣ 抗体特异性问题
有些抗体不仅识别目标蛋白，还会与相似序列的其他蛋白发生交叉反应。这些交叉反应的蛋白分子量不同，就会出现多个条带。
2️⃣ 抗体质量或保存问题
如果抗体质量不佳或保存不当，可能会失效或降解。失效的抗体无法有效识别目标蛋白，或者结合能力下降，影响WB结果的准确性。
🎯 如何确保样本裂解充分？
1️⃣ 选择合适的裂解缓冲液
比如RIPA缓冲液，适用于大多数细胞和组织样本，能有效破坏细胞膜，释放蛋白质。同时，加入蛋白酶抑制剂（如PMSF、亮抑酶肽等），可以防止蛋白质降解。
2️⃣ 保持低温操作
在裂解过程中，保持低温（0-4℃），可以防止蛋白质降解和变性。
3️⃣ 优化裂解方法
对于细胞样本，可以用超声波裂解或机械匀浆；对于组织样本，先剪碎，再加入裂解缓冲液研磨或匀浆。
4️⃣ 离心去除杂质
裂解完成后，将裂解液置于4℃下以10,000-15,000g的速度离心10-20分钟，去除不溶性杂质和细胞碎片，取上清液进行后续实验。
5️⃣ 检查裂解效果
可以通过观察裂解液的外观（均匀液体状，无沉淀）或进行SDS-PAGE电泳检测来确认裂解是否充分。
WB实验条带异常，可能是蛋白质本身特性、实验操作或抗体问题导致的。只要注意这些细节，就能避免很多“坑”。下次做WB实验，按照这些方法来，实验成功率蹭蹭往上涨，科研路上一路顺风！🚀
毕合生物(www.bihebio.com)提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物
来源：毕合生物MBC