免疫共沉淀技术（co-Immunoprecipitation,Co-IP）是一种研究两种蛋白在体内是否存在相互作用的有效方法。01实验原理免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（Protein A/G）偶联的agarose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目的蛋白复合物，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。摘要：免疫共沉淀技术（co-Immunoprecipitation,Co-IP）是一种研究两种蛋白在体内是否存在相互作用的有效方法。
图3. IP后WB1.一次完整严谨的CoIP实验，应当包含IgG对照组、IP实验组以及Input组；2. Input泳道所点样本与IP前WB一致，作为阳性对照；3. 判定CoIP实验成功的标准，是能够在IP泳道检测到诱饵蛋白信号，且IgG泳道检测不到；如果IgG泳道也检测到诱饵蛋白，说明该蛋白能够与所有IgG类的抗体结合，只能换别的实验如酵母杂交、GST pulldown等来验证。4.在IP后能够检测到诱饵蛋白的前提下，如果检测不到猎物蛋白，说明两个蛋白不互作，至少在这个样本和实验体系下不互作，并不代表实验本身有问题；5.CoIP后往往会在IgG和IP泳道出现目的条带以外的杂带，这是由于CoIP实验会往实验体系中加入抗体进行富集，这些抗体最终也会也会被WB的二抗识别到；6.抗体由轻链和重链构成，轻链分子量约为25KD，重链分子量约为50-70KD，如图3所示，由于使用了识别轻链的二抗，因此IgG和IP泳道均在25KD左右出现了抗体链条带；7.在做IP后WB时，为了避免抗体链对结果的干扰，应灵活选择二抗，如左图所示，由于目的条带在重链范围，因此选择了识别轻链的二抗。常见问题与解决方案Q
IgG组及IP组均检测到目的条带，为什么？A
Co-IP WB鉴定结果IgG组无目的蛋白条带、IP组有目的蛋白条带，说明IP过程成功，此时质谱极低概率会在IgG组中鉴定到目的条带，如果遇到这种情况可能是在切胶及质谱样品处理过程中发生了串染，对IP组中互作蛋白的结论没有影响，IgG组中的蛋白在文章中通常都不是考察对象。
QIP后WB鉴定到目的蛋白，质谱未鉴定到，为什么？A
IP后WB检测到目的蛋白条带，说明IP过程成功。我们从自身技术流程步骤做排查，确保相关质控均合格，通过标准品检测质谱当时的状态正常，保证技术流程及质谱性能均无问题。如果确实质谱未发现目的蛋白，通常是由于蛋白本身在样品中相对丰度较低导致，由于质谱过程中其他相对高丰度的蛋白可能掩盖部分信号、导致样品中低丰度蛋白未被鉴定。
QCo-IP实验成功的评判标准?A
在 Co-IP-WB鉴定结果中，IgG组无目的蛋白条带、IP组有目的蛋白条带，说明IP过程成功；银染胶图中，IP组相对于IgG组有更多蛋白条带、且存在差异，说明 Co-IP过程捕获到互作蛋白；IP产物在质谱检测中鉴定到的蛋白数量不能作为判断实验成败的标准，因为这取决于目的蛋白本身所具有的互作蛋白数量、结合力强弱等方面；IP产物的质谱鉴定数量越多并不代表结果越好。
Co-IP需要准备多于多少样本量？是的。Co-IP实验需要保证足够的蛋白浓度才能维持原本存在的蛋白互作状态，尤其当蛋白丰度较低、相互作用力不强、使用不易提蛋白组织等情况时。而且 Co-IP的实验条件往往需要反复摸索。因此用于 Co-IP实验需准备细胞＞2x107，动物组织＞500mg，植物组织＞2g，并且须更加注意采集后速冻-80℃保存和避免反复冻融。a.所使用的抗体不仅需要优秀的亲和力、特异性，其识别表位还可能被互作蛋白所掩蔽（主要是使用单抗时）；
b.当蛋白互作须发生在特定生理代谢条件、组织细胞类型之中时， Co-IP实验可能无法获得互作结果；
c.如果诱饵蛋白和或捕获蛋白在样本中丰度很低时；
d.两个互作蛋白的亲和力较弱；
e.当该蛋白互作需要较特定的离子强度，或者需要如Ca离子/Mg离子/ATP等辅因子时，要创造合适的反应条件会变得困难；
f.一些样品处理提取存在难度，提取足量目的蛋白与保持蛋白天然状态，需通过实验条件达到优化平衡；
g.外源表达的标签蛋白存在同内源蛋白的位点竞争，这主要在使用标签抗体进行实验时可能存在。
来源：金开瑞生物