摘要：我们的大脑，这个宇宙中最复杂的结构，其奥秘隐藏在数十亿神经元（neurons）之间，它们以毫秒级的高速电信号（Action Potentials, APs）进行着无休止的“对话”，构建出我们感知、思考和记忆的宏伟图景。长期以来，研究人员梦寐以求的，就是能“看清

我们的大脑，这个宇宙中最复杂的结构，其奥秘隐藏在数十亿神经元（neurons）之间，它们以毫秒级的高速电信号（Action Potentials, APs）进行着无休止的“对话”，构建出我们感知、思考和记忆的宏伟图景。长期以来，研究人员梦寐以求的，就是能“看清”这些微小而瞬时的“电火花”，从而解码大脑的语言。

然而，这双“眼睛”一直被一层浓重的“迷雾”所遮蔽——大脑组织的散射（tissue scattering）。当光线穿过致密的脑组织时，会发生严重的散射，导致图像模糊，尤其是在对那些密集排布、信号重叠的神经元进行宽场（widefield）成像时，根本无法分辨它们的独立活动。研究数据显示，单个神经元的平均光学足迹（optical footprint）在成像深度140微米时可达约35微米，远超神经元间距，这意味着即使在光学上相距较远的神经元，它们的荧光信号也可能严重混叠。这种严重的交叉干扰（cross-talk）使得传统方法难以精准捕捉单个神经元的“心跳”。

5月19日《Nature Methods》的研究报道“Imaging neuronal voltage beyond the scattering limit”，介绍了一项突破性技术：活动局部化成像（Activity Localization Imaging, ALI），以其惊人的清晰度，帮助我们拨开这层“迷雾”！它借鉴了超分辨显微镜（super-resolution microscopy）的精髓，并没有试图直接“磨平”模糊，而是巧妙地利用了一个生理特性：神经元在任何给定时刻的活动都是稀疏的（sparse activation）。就像在繁星点点的夜空中，ALI能够精确捕捉每一颗星最闪亮的那一瞬，并以亚像素（subpixel）精度记录其位置，最终“拼凑”出一幅远超传统图像的清晰“活动星图”。

这项研究揭示，ALI能将神经元的活动定位精度提高“十倍以上”！那些在传统方法下被混淆的信号，如今能被清晰地分离出来，让研究人员第一次真正地“看清”了每个神经元独立的“心跳”。更令人兴奋的是，这项技术已经在小鼠海马区（hippocampus）的实验中大放异彩，首次以细胞分辨率（cellular resolution）绘制出复杂脑节律——Theta振荡的精细图谱，并揭示了在密集局部网络中，相邻神经元对Theta振荡的相位锁定（phase locking）竟然存在显著多样性。ALI不仅仅是一个工具，它更像是一把钥匙，为我们打开了通往大脑微观世界的新大门。

迷雾重重：传统神经元成像的“阿喀琉斯之踵”

长期以来，为了记录神经元群体活动，研究人员尝试了各种方法。其中，宽场显微镜（widefield microscope）以其高帧率（kilohertz speed）和宽视野（large fields of view）的优势脱颖而出。例如，在这项研究中，研究人员使用了一种名为Voltron2的电压指示剂，并以每秒2000帧的速度对小鼠海马区（hippocampus）CA1锥体神经元（pyramidal neurons）的电压活动进行成像。

然而，宽场成像也面临着巨大挑战。大脑组织的散射效应使得神经元的“光学足迹”（optical footprint）非常宽广。研究数据表明，在成像深度为140微米时，单个神经元的平均光学足迹宽度（半峰全宽，full width at half-maximum）约为35 ± 9 微米。这个宽度远大于海马区神经元之间典型的距离，这意味着即使在光学上相距较远的神经元，它们的荧光信号也可能严重重叠。在研究人员提供的宽场图像中，可以清晰地看到，神经元区域的图像非常模糊，难以分辨出独立的细胞轮廓。当多个神经元紧密排布时，它们的信号会混杂在一起，形成一团无法辨识的光晕，使得我们无法准确地将荧光变化归因于特定的神经元。这种严重的交叉干扰（cross-talk）不仅模糊了神经元的身份，更阻碍了我们提取高精度的实时动态信息。

为了应对这一问题，一些现有算法如VolPy和SGPMD-NMF也尝试从电压成像数据中提取神经元活动。这些算法通常依赖于神经元的平均荧光强度或神经元之间的相关性来识别细胞。虽然它们在某些场景下表现良好，但在神经元高度密集、信号严重重叠的情况下，它们往往力不从心。模拟数据显示，当两个神经元的间距小于其光学足迹的宽度时，这些算法就无法准确地检测出两个独立的神经元，而是将它们的信号合并为一个，导致提取出的活动轨迹是两个神经元信号的混合体。这使得在真实、复杂的神经网络中，要准确捕捉单个神经元的活动，变得异常困难。

点亮黑暗：ALI如何“看穿”神经元的“真身”？

ALI的巧妙之处在于，它并没有试图直接“磨平”散射造成的模糊，而是利用了神经元活动本身的一个关键特性：尽管神经元在空间上分布密集且信号重叠，但在任何给定时刻，只有少数神经元会发射动作电位。这种稀疏激活（sparse activation）的特性，为ALI提供了“逐个击破”重叠信号的机会。

ALI的原理与局部化显微镜非常相似，后者通过分时激活稀疏分布的荧光分子，并精确确定每个分子的中心位置，最终“拼凑”出超越光学衍射极限的超分辨图像。ALI将这一思想应用到了神经元电活动成像中：

捕捉“瞬时闪光”：首先，研究人员对原始的荧光图像进行高通滤波，突出显示那些由动作电位引起的快速荧光变化。这些变化被视为“瞬时闪光”，代表了神经元的活动。通过检测这些荧光信号的峰值，研究人员能够捕捉到所有动作电位的发生时刻。

构建“活动指纹”：对于每一个检测到的动作电位，研究人员会提取其峰值时刻的荧光变化图像，称之为“AF图像”（AF image）。这些AF图像本质上就是动作电位发生时，特定神经元激活所留下的“活动指纹”。为了进一步提高信噪比，研究人员还采用了奇异值分解（SVD）进行去噪处理。

精准“定位”中心：接下来，ALI的核心步骤来了。对于每个去噪后的AF图像，研究人员会通过计算荧光信号的质心（center of mass localization），以亚像素（subpixel）的精度确定该动作电位发生时的精确中心位置。即使在宽场图像中，一个神经元可能覆盖了数十个像素，但ALI能够将动作电位发生时的核心激活区域定位到单个像素以下，实现超高的局部化精度。

绘制“活动热图”：将所有动作电位的中心位置累积起来，研究人员就构建了一幅“动作电位密度图”，也就是所说的ALI图像（ALI image）。在这幅图中，亮度越高，表示该位置发生动作电位的可能性越大。ALI图像就像一张高精度的“神经元地图”，清晰地显示出不同神经元活动的核心区域。

智能“聚类”分离：通过简单的峰值检测算法，ALI图像中的密集动作电位点被自动分组为独立的“簇”（clusters）。每个簇代表一个独立的神经元。在研究展示的示例中，宽场图像中模糊不清的区域，通过ALI能够清晰地分辨出四个不同的神经元簇，这种分辨率提升达到了惊人的“数倍”，甚至在某些情况下，比神经元的光学足迹小了“十倍以上”！这意味着，典型光学足迹宽度为34微米的神经元，通过ALI的精确质心定位，其活动核心区域的“表观大小”可以缩小到约3.2微米！

提取“纯净”活动轨迹：一旦确定了每个动作电位所属的神经元簇，研究人员就能平均每个簇的AF图像，得到每个神经元的“纯净”光学足迹。然后，利用最小二乘回归（least-squares regression）方法，将原始图像数据分解为各个神经元的活动轨迹。这些轨迹不仅包含了动作电位信息，还能揭示亚阈值（subthreshold）电压动态。研究结果显示，通过ALI提取的活动轨迹，不同神经元之间的交叉干扰极低。即使是那些在宽场图像中看起来像是同一个点的神经元（比如研究中提到的簇a和簇b），ALI也能将它们的活动清晰地分开，彼此之间的干扰几乎可以忽略不计。此外，提取出的神经元自相关图（auto-correlograms, ACGs）清晰地显示出不应期（refractory period），这与真实神经元的生理特性高度一致，进一步证明了信号的纯净度。

ALI的“硬核”实力与超凡表现

这项研究通过严谨的模拟和活体实验，充分展示了ALI相对于现有算法的卓越性能。

模拟数据：挑战极限，ALI一骑绝尘

研究人员模拟了两个具有固定光学足迹大小（宽度为w）的神经元，并系统性地改变它们之间的间距（s），从1.25w逐渐缩小到0.25w，模拟神经元间重叠程度的增加。

当间距s ≥ w时（即重叠不严重时），包括VolPy和SGPMD-NMF在内的所有算法都能成功识别出这两个神经元。

然而，当间距s

而ALI，即使在最极端的0.25w间距下，依然能够准确分辨出这两个模拟神经元！它忠实地恢复了两个神经元的“光学足迹”，并提取出与真实活动轨迹高度匹配的信号。这无可争议地证明了ALI在处理高度重叠神经元信号时的超凡能力。

活体数据：捕捉百余神经元的“群体交响乐”

研究人员在小鼠海马区活体同时成像了超过100个密集标记的神经元，速度高达每秒2000帧。通过ALI，他们识别出113个独立的神经元簇，每个簇包含6到1864个动作电位。

更高的细胞识别率：在同一活体数据集上，ALI的细胞识别数量显著优于现有算法。研究发现，ALI识别出的神经元数量比SGPMD-NMF和VolPy多出约35%到60%。这意味着ALI能够让我们同时研究更多的神经元。

更低的交叉干扰： 这是一个至关重要的优势。研究表明，通过ALI提取的相邻神经元活动之间的相关性非常低，平均相关系数仅为0.06。这与传统方法（如简单地在图像中选择感兴趣区域ROI并测量其平均荧光）形成鲜明对比，ROI方法的相邻区域活动相关性高达0.90，这意味着严重的交叉干扰。

更纯净的动作电位：ALI提取的动作电位自相关图（ACGs）显示出清晰的不应期，这意味着一个神经元在短时间内（通常是1.5毫秒内）不会连续发射两个动作电位，这符合神经元的生理特性。然而，通过ROI方法获得的活动轨迹，却经常出现不应期内出现第二个“动作电位”的事件（ISI violation events），在某些ROI轨迹中，这类事件的比例高达100%！这进一步证实了ROI方法所受到的严重交叉干扰，而ALI则有效地避免了这些误差，确保了提取信号的纯净性。

精准匹配真实结构：为了验证ALI识别出的“簇”是否对应真实的神经元，研究人员在电压成像实验后，对同一区域进行了双光子显微镜（two-photon microscope）的结构成像。结果令人惊喜：ALI识别出的所有113个簇都与双光子图像中独立、结构清晰的神经元精确对应！甚至对于那些位于不同焦平面、但XY平面间距小于单个神经元宽度的神经元，ALI也能将其信号清晰分离。这充分证明了ALI不仅提高了功能分辨率，还具有极高的结构准确性。

通用利器：ALI在多模态成像中的“降维打击”

ALI的强大之处不仅体现在宽场成像中，它还能广泛应用于其他先进的神经成像技术，如靶向照明（targeted illumination）和光片显微镜（light sheet microscopy）。这些技术本身已经能够显著减少离焦污染（out-of-focus contamination），但组织散射仍然是分辨紧密排列神经元的障碍。

靶向照明下的惊喜： 在靶向照明显微镜中，通常认为每个被光斑照亮的区域只包含一个神经元。然而，ALI的分析却揭示了令人意想不到的结果：在某些看似只照亮了一个神经元的光斑下，ALI竟然能分辨出多个独立的神经元！这意味着ALI能够从看似“单一”的信号中，解析出隐藏的“多重”来源。

光片显微镜下的突破：同样，在光片显微镜下，ALI也能够识别出那些在传统光片图像中无法区分的神经元。尽管光片显微镜已经能够仅照亮薄薄的一层神经元，但ALI仍能进一步提高其分辨率，揭示更精细的神经元活动。

这些结果充分证明了ALI的通用性，它能够跨越不同的成像模态，在各种实验条件下提升神经活动的区分能力，从根本上解决组织散射带来的分辨率限制。

拨云见日：ALI揭示海马区Theta振荡的“微观”奥秘

海马区在学习和记忆中扮演着关键角色，其特有的4-10赫兹theta振荡（theta oscillations）被认为是突触可塑性（synaptic plasticity）和记忆形成的基础。虽然电生理记录已经揭示了海马CA1神经元与theta振荡的相位锁定（phase-locked spiking）现象，但传统的微电极记录无法提供精细的空间分布信息，尤其是在相邻神经元之间，我们很难知道它们在脑振荡中是否扮演着不同的角色。

ALI的出现，首次让研究人员有机会在如此精细的空间尺度上，同时记录数百个CA1锥体神经元的活动，并以前所未有的速度捕捉到这些快速的振荡动态。

揭示多样性：研究发现，即使是那些在空间上紧密相邻（间距小于35微米）的神经元对（共分析了40对），它们对theta振荡的相位锁定强度（phase-locking strength）和偏好相位角（preferred phase angles）也表现出显著的差异！这意味着，在微观层面，相邻神经元并非“铁板一块”，它们可能在参与脑振荡时表现出独特的个体特性。

排除偶然性：为了证明这种多样性并非由于随机归因错误，研究人员进行了对照实验：当他们随机将动作电位分配给神经元，而不是基于精确的局部化信息时，神经元间相位锁定强度和偏好相位角的差异显著减小。这有力地证明了ALI所揭示的相位调制多样性是真实存在的，而非偶然。

这项发现具有深远意义。它表明，ALI能够帮助我们绘制出theta相位锁定的精细空间图谱，这是传统电生理学和钙成像（calcium imaging）都无法实现的。这种精度对于理解相邻神经元如何在脑振荡中协同工作以支持高级认知功能至关重要。

未来：无限可能的大脑地图

ALI技术的问世，为电压成像带来了革命性的突破，它将超分辨成像的理念从分子层面拓展到了活体神经元活动层面。这项技术通过精确地局部化动作电位，有效克服了组织散射带来的分辨率限制，实现了在活体密集神经元群体中高精度、高速度的信号提取。

未来，ALI仍有巨大的发展潜力。随着电压指示剂亮度和灵敏度的进一步提升，以及更先进去噪算法（denoising algorithms）的开发，ALI的局部化精度和信号分离能力将持续增强。此外，光稳定性（photostability）和记录时长（recording duration）的改进将提供更多的动作电位事件，从而有助于识别那些活动较弱的神经元。在硬件方面，光学切片显微镜（optical sectioning microscopes）速度的提升将进一步减少离焦污染，提高记录质量。值得一提的是，ALI在低像素数量下也能分辨神经元的能力，对于扫描显微镜（scanning microscopes）而言，像素数量的减少意味着更快的成像速度，这无疑将加速我们绘制大脑电压动态完整图谱的步伐。

这项研究不仅为神经科学提供了一个强大的新工具，还首次在概念上将大脑记录中的信号分离与超分辨显微镜中的精细结构解析联系起来。这一联系可能促进这两个传统上独立领域之间的思想交叉，例如，局部化显微镜中关于像素密度和算法选择如何影响局部化精度的见解，可能会指导未来神经活动分离的实践。

ALI的诞生，标志着我们离完全理解大脑中复杂而精妙的神经回路又近了一步。它将帮助研究人员更清晰地“阅读”神经元的“对话”，探索神经活动与神经网络连接、细胞形态以及特定分子标记之间的关系，最终揭示大脑如何编码感知、行为和思想的深层机制。

让我们拭目以待，这项“超分辨”技术将如何引领神经科学迈入一个全新的时代！

参考文献

Chen TW, Huang XB, Plutkis SE, Holland KL, Lavis LD, Lin BJ. Imaging neuronal voltage beyond the scattering limit. Nat Methods. 2025 May 19. doi: 10.1038/s41592-025-02692-5. Epub ahead of print. PMID: 40389606.

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来源：生物探索一点号1