摘要：近日，生物工程及技术领域国际权威经典期刊Biotechnology and Bioengineering在线发表了大连理工大学生物工程学院智能生物制造教育部重点实验室，孔凡涛副教授研究团队题为“Photoproduction of Aviation Fuel
近日，生物工程及技术领域国际权威经典期刊Biotechnology and Bioengineering在线发表了大连理工大学生物工程学院智能生物制造教育部重点实验室，孔凡涛副教授研究团队题为“Photoproduction of Aviation Fuel β-Caryophyllene from the Eukaryotic Green Microalga Chlamydomonas reinhardtii”的研究论文。首先，该研究通过合成生物学及代谢工程改造，补齐β-石竹烯合成的关键酶QHS，构建了生产β-石竹烯合成途径，实现β-Caryophyllene了光合生物合成。进一步研究发现，MEP通路关键酶的过表达结合IPP和DMAPP水平的平衡可以进一步提高β-石竹烯的产量。此外，发现β-石竹烯合成藻株的细胞生长和光合活性，与亲本系相比没有显著变化。该工程菌株可能对β -石竹烯的光驱动的可持续生产有潜在的应用价值。
摘要：
β-石竹烯是一种植物来源的倍半萜，被认为是航空燃料的一种很有前途的成分。微藻可以转化 CO2通过光合作用转化为富含能量的化学品，使其成为可持续生产倍半萜的潜在平台。然而，微藻中的异源倍半萜合生产仍处于起步阶段，真核光合微生物中 β-石竹烯的产生尚未见报道。在这项研究中，作者通过异源表达 β-石竹烯合酶 （QHS），成功地在模型真核微藻 Chlamydomonas reinhardtii 中产生了 β-石竹烯。此外，在表达 QHS 的藻株中过表达 2-C-甲基-D-赤藓糖醇 4-磷酸途径的关键酶藻株中（QHS-DXS-HDR-18），β-石竹烯的产生比 QHS 的单一表达 （QHS-28） 高 17 倍。此外，异戊烯基二磷酸异构酶 （CrIDI） 进一步过表达的QHS-DXS-HDR-CrIDI-16 中 β-石竹烯的产量高达 480.6 μg/L，与亲本藻株 QHS-DXS-HDR-18 相比增加了 1.8 倍。在光生物反应器的光合自养和光混合营养条件下，QHS-DXS-HDR-CrIDI-16 中的 β-石竹烯产量分别达到 854.7 和 1016.8 μg/L。值得注意的是，与未转化的藻株相比，本研究中产生的所有产生 β-石竹烯的藻株均未对细胞生长和光合作用活性产生不利影响。本研首次成功在真核微藻 C. reinhardtii 中生产 β-石竹烯，开发了一种增加真核光合微生物中倍半萜产量的新策略。简介：
β-石竹烯是一种常见的倍半萜，广泛分布于植物中。据报道，β-石竹烯因其高能量密度而有望作为替代飞机燃料。此外，由于其抗氧化和抗炎活性，β-石竹烯显示出潜在的治疗特性 (Harvey等人2014；Tsigoriyna， Sango和Batovska 2024；Yang et al . 2016)。此外，β-石竹烯通常被认为是安全的，并被美国食品和药物管理局（FDA）批准用作食品添加剂，通常用作调味剂（Richter et al 2021）。与其他倍半萜类似，β-石竹烯由常见的前体IPP和DMAPP产生，可以通过2‐C‐甲基‐D‐赤藓糖醇4‐磷酸（MEP）或甲羟戊酸（MVA）途径合成（steinbchel 2003）。目前β-石竹烯等倍半萜的主要来源是从其天然宿主植物中提取，但由于其浓度低，回收率差（Huang et al . 2023）。化学合成是生产倍半萜烯的一种替代方法，但由于工艺复杂且成本高（Andersen‐Ranberg et al . 2016）。迫切需要开发新的平台，以可持续和具有成本效益的方式生产高价值萜类化合物。
微藻可以转化 CO2通过光合作用转化为富含能量的生物产品，使其成为可持续生产倍半萜的潜在平台。然而，微藻中的异源倍半萜生产工程仍处于起步阶段，真核光合微生物中 β-石竹烯的产生尚未见报道。在这项研究中，作者研究了模式真核绿色微藻C. reinhardtii生产β-石竹烯的潜力，开发了一种针对MEP途径的多步骤代谢工程方法来提供前体，并结合原位提取方法来减轻β-石竹烯的毒性。本研究首次证明了在衣藻中，通过表达β-石竹烯合成酶来合成β-石竹烯。此外，MEP通路关键酶的过表达结合IPP和DMAPP水平的平衡可以进一步提高β-石竹烯的产量。此外，作者发现β-石竹烯产生藻株的细胞生长和光合活性与亲本系相比无显著的变化。这些工程藻株可能对β-石竹烯的光驱动的可持续生产有潜在应用价值。实验结果：
1. 在衣藻中构建β-石竹烯合成途径
作者首先将青蒿来源 (A. annua) 来源的 β-石竹烯合成酶基因合成并克隆到pOpt_mVenus_Paro质粒中，构建了QHS表达载体（图1A），导入莱茵衣藻UVM4藻株，通过克隆PCR筛选，RT-PCR和Western blot等分子验证，获得高表达藻株QHS-28（图1B, C）。QHS高表达藻株中（QHS-28），β-石竹烯可达到13.56 μg/L（图1D, E）。上述实验结果表明，莱茵衣藻中含有β-石竹烯合成的前体物质，引入QHS可实现β-石竹烯合成。
图1. 莱茵衣藻核基因组QHS异源表达合成β-石竹烯
2. 优化MEP通路关键酶促进β-石竹烯生成
进一步在QHS-28藻株中过表达DXS和HDR基因（图2A-C），获得的QHS-DXS-HDR-18藻株的β-石竹烯产量为270.3 μg/L（图2D），比QHS-28和空载体（EV1）转化的QHS-28藻株的β-石竹烯产量高20倍（图2D）。这些结果表明，在QHS转基因藻株中外源表达DXS和HDR显著提高了莱茵石竹β-石竹烯的产量。
图2. MEP通路关键酶的过表达促进β-石竹烯的产生
3. 平衡IPP和DMAPP丰度促进β-石竹烯生成
IDI催化IPP与其异构体DMAPP之间的相互转化（Kaneda et al . 2001）。作者研究了过表达天然C. reinhardtii IDI1 （CrIDI）对β-石竹烯产生的影响。构建了含有内源CrIDI编码序列的表达载体（图3A），通过电穿孔法将其导入QHS-DXS-HDR-18藻株中。与对照藻株相比，这些QHS-DXS-HDR-CrIDI转化体中β-石竹烯的产量显著增加（图3D）。例如，藻株QHS- DXS-HDR-CrIDI-16的β-石竹烯产量达到480.6 μg/L，分别是藻株QHS-DXS-HDR-18和QHS-28的1.8倍和35倍（图3D）。然而，QHS-DXS-HDR-18与表达QHS-DXS-HDR-18藻株的空载体之间没有显著差异（图3D）。这些结果表明，除了DXS和HDR外，CrIDI对微藻β-石竹烯产量的增加也至关重要。上述实验结果表明，提高参与MEP途径和倍半萜合成末端步骤的限速酶的表达是显著提高微藻β-石竹烯产量的有效策略。
图 3. 过表达IPP异构酶提高衣藻β-石竹烯产量
4. 利用光生物反应器进行β-石竹烯生产
作者进一步对QHS-DXS-HDR-CrIDI高表达藻株（#16）进行十二烷覆盖的大规模培养，评估了β-石竹烯的光养产量（图4A）。在这两种培养条件下对细胞生长进行监测和比较。结果显示，在光混合营养条件下，细胞在3天后进入静止期，8天后生长下降（图4B）。在光自养条件下，细胞生长相对缓慢，8天后达到稳定期（图4B）。在光自养（3% CO2）和光混合养（醋酸+ 3% CO2）条件下，β-石竹烯的产量在整个培养过程中稳步增加。光自养条件下，β-石竹烯的最大产量为854.7 μg/L，光光混合营养条件下达到1016.8 μg/L（图4C）。值得注意的是，在光混合营养条件下β-石竹烯的产量比光自养条件下更早达到峰值（图4C）。这些结果表明β-石竹烯的产生与细胞生长是耦合的。乙酸的添加可以促进细胞生长，从而提高β-石竹烯的产量。即使在细胞停止生长后，β-石竹烯的生产仍在继续，这表明光合作用固定的二氧化碳可以有效地利用于β-石竹烯的生产。5. β-石竹烯合成工程藻株的生理变化
在存在和不存在十二烷覆盖培养的情况下，对β-石竹烯合成工程藻株的生理变化也进行了评估。作者发现，无论是否存在十二烷覆盖层，光系统II的细胞生长和最大量子效率（Fv/F）在所有产生β-石竹烯的藻株和未转化的PL之间都无显著变化（图5A，B和S6A，B）。此外，与PL相比，QHS、QHS-DXS-HDR和QHS-DXS-HDR-CrIDI表达株的细胞大小和叶绿素含量保持不变（图5C、D和S6C、D）。这些结果表明，合成β-石竹烯的工程藻株的细胞生长和光合活性没有受到负面影响。综上所述，β-石竹烯的合成对工程藻类的细胞生长和光合作用活性没有任何明显的不利影响 。图 5. β-石竹烯合成工程藻株的生理变化
总结：在这项研究中，作者首次成功地在真核微藻C. reinhardtii中生产了航空燃料β-石竹烯。这是通过QHS的异源表达、MEP通路关键酶的工程设计以及IPP和DMAPP丰度的平衡实现的（图6）。值得注意的是，与未转化的亲本藻株相比，所有产生β-石竹烯的藻株在生理特性上没有显着变化。
图6. 莱茵衣藻生物合成异源β-石竹烯的基因工程示意图。
文章链接：
该研究由大连理工大学生物工程学院智能生物制造教育部重点实验室孔凡涛副教授研究团队完成、大连理工大学分析测试中心和中国科学院沈阳应用生态研究所合作参与。该工作得到了中国国家自然科学基金委、辽宁省自然科学基金面上项目和中央高校基本科研业务费的支持。
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来源：昕樾聊科学