【海湿讯】颠覆传统保存方法，阳离子表面活性剂提高eDNA提取效率

摘要：eDNA分析是一种强大的工具，用于量化和评估环境中生物体的多样性。但是往往，由于水样采集、运输过程中的样品保存和现场过滤等困难，从水生环境中分离eDNA是一项挑战。本文来源于“海洋与湿地”（OceanWetlands）：文 | 王芊佳（编译）

eDNA分析是一种强大的工具，用于量化和评估环境中生物体的多样性。但是往往，由于水样采集、运输过程中的样品保存和现场过滤等困难，从水生环境中分离eDNA是一项挑战。

本文来源于“海洋与湿地”（OceanWetlands）：

文 | 王芊佳（编译）

海

湿

编

按

【编者按】eDNA分析是一种强大的工具，用于量化和评估环境中生物体的多样性。但是往往，由于水样采集、运输过程中的样品保存和现场过滤等困难，从水生环境中分离eDNA是一项挑战。这些过程不仅昂贵且耗时，还可能导致eDNA降解。2024年11月23日，《环境DNA》期刊发表了一项由瑞典Örebro大学研究团队完成的研究，作者包括Viresh Thamke、Yared H. Bezabhe、Jana Jass和Per-Erik Olsson。该团队提出了一种利用阳离子表面活性剂保存水体环境DNA（eDNA）的新方法，为提升水生生态系统的物种监测效率提供了突破。为助力全球环境治理、并供我国学者了解最新研究动态信息，编译分享信息如下，供感兴趣的读者们参阅。因篇幅所限有所简略，译文仅供参考。（按/王芊佳）

本文约4000字，阅读约8分钟

为了解决这些难题，一种新的方法是通过在采集的水中保存eDNA。该研究评估了三种不同阳离子表面活性剂对斑马鱼（Danio rerio）线粒体DNA（mtDNA）在微观世界水中的半衰期的短期和长期水储存的影响。所使用的表面活性剂为苯扎氯铵（BAC）、氯化十六烷基吡啶（CPC）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）。

研究结果表明，CPC和CTAB处理可将mtDNA的半衰期延长3-5倍。通过定量聚合酶链反应（qPCR）分析，与未处理的水相比，CPC、CTAB和BAC在30天后的mtDNA保留率分别为17.6%、26.3%和2.2%，而未处理的水仅为0.1%。阳离子表面活性剂对mtDNA的保存作用归因于其杀菌和细胞毒性特性，以及它们与DNA分子之间的静电相互作用，如通过荧光光谱分析和后续沉淀所观察到的。这项的研究结果确认，这是一种廉价且方便的方法来保护水中的eDNA并改善其提取。

卡塔尔的浅水珊瑚调查。上面是深度约5-8米的珊瑚礁。摄影：王敏幹（John MK Wong） | 绿会融媒·“海洋与湿地” （图文无关）

研究介绍

我们知道，环境DNA（eDNA）分析是一种快速、高效的生态监测技术，可以精准探测和描述生态系统中生物的空间分布，同时评估种群的组成和数量。通过采集空气、土壤和水等环境样本，eDNA分析在水体环境研究中尤为重要。它不仅能以非侵入性的方式检测稀有物种，还可对多个营养级的生物进行分类和群组分析。与传统的捕捉和物理鉴定方法相比，eDNA分析速度更快、成本更低，同时具有更高的敏感性和准确性。

但是，这项技术在实际应用中仍然面临诸多挑战。环境中的DNA容易受到降解、污染及操作不当的影响，从而影响检测结果的准确性。尤其在水体环境中，温度、pH值、盐度等物理化学因素以及微生物活动的影响，使得eDNA的保存和分析变得尤为复杂。因此，如何有效保存eDNA、并优化其分析过程，成为这一领域的关键研究方向。

eDNA的降解问题是影响分析准确性的主要障碍之一。在水体环境中，DNA降解主要由细菌活性及光照、温度等外部条件所驱动。例如，在30°C条件下，欧洲鳗鲡（学名：Anguilla anguilla）eDNA的降解速度显著快于低温环境。同样，在高温条件下，欧洲林蛙（学名：Rana temporaria）eDNA在短短几天内便会降解超过80%。为应对这一问题，采集的样本通常需快速冷冻保存，储存温度要求在−20°C至−40°C之间。然而，这一高标准对偏远地区的采样工作提出了严格的技术和设备要求。即便使用现场过滤法减少降解风险，也会因水体浑浊度增加过滤时间，同时增加交叉污染的可能性。

研究人员目前正在探索多种化学储存液（如乙醇或裂解缓冲液）在eDNA保存中的作用。但这些方法在实际应用中存在局限性，例如乙醇保存样本的eDNA回收率较低，限制了其效果。因此，开发一种简便、经济且高效的eDNA保存方法，显得尤为重要。

为解决这一难题，研究人员提出了通过阳离子表面活性剂（如苯扎氯铵）处理水样，以延缓eDNA降解并提高回收率的策略。实验表明，经这种化合物处理的样本，数小时后仍能保留大部分eDNA。这种方法在无需严格冷冻条件的情况下，能够显著改善偏远地区的eDNA监测工作。然而，阳离子表面活性剂虽然对DNA保存有效，却可能与DNA发生物理或化学相互作用，从而影响后续的定量分析。为此，研究人员优化了实验流程，通过样本预处理和离心步骤解决了这一问题。此外，他们进一步测试了这种化合物对水体中代表性微生物和细胞的影响，发现其不仅能有效延缓DNA降解，还具备一定的抗菌作用。

在具体分析过程中，研究人员结合定量PCR（qPCR）和数字PCR（ddPCR）技术，对样本中的eDNA进行了精准的定量测定。与传统方法相比，ddPCR在低浓度和低质量样本的检测中表现出更高的灵敏度，尤其在成分复杂的环境样本中，能提供更准确的定量结果。这种技术改进大幅提高了eDNA分析的可靠性，使其在水体生物多样性监测中具有更广泛的应用潜力。

材料与方法

实验所需的主要化学试剂包括购自Sigma Aldrich公司的BAC、CPC和CTAB，纯度为98%~99%。用于DNA提取的试剂盒DNeasy PowerWater Kit来自Qiagen公司，其他试剂则由Merck、Thermo Fisher Scientific和Bio-Rad公司提供。

实验设计中，研究者设置了三个30升的中型模拟生态水箱，每箱按照5条斑马鱼每升的密度养殖斑马鱼，饲养5天后进行水样采集。实验前，水箱以10%的漂白液浸泡15分钟，随后使用去离子水反复冲洗。斑马鱼饲养期间，水温保持在22°C±2°C，光照与黑暗周期为14小时和10小时。采样前，斑马鱼通过干净的细孔网捞出。随后，将每箱的水样转移至10升塑料容器中，并分别加入0.01%的BAC、CPC或CTAB，通过充分摇匀确保混合均匀，随后在室温下存放进行后续分析。时间点为0小时的水样在加入表面活性剂后立即过滤，未添加任何表面活性剂的水样作为空白对照组。

eDNA的提取在采样后30分钟内完成。每次取500毫升水样通过0.45微米孔径的硝酸纤维素滤膜过滤，滤膜随后使用Qiagen试剂盒中的PowerWater DNA Bead Tube进行DNA提取。DNA浓度通过DeNovix DS-11分光光度计测定。

研究还采用实时荧光定量PCR（qPCR）和数字PCR（ddPCR）技术检测斑马鱼线粒体DNA的变化。为实现特异性检测，设计了一对针对线粒体细胞色素b（cyt b）区域的引物，并通过PrimerBlast软件验证其特异性。qPCR反应条件包括95°C预变性2分钟，接着40个循环的95°C变性5秒和60°C退火30秒。ddPCR实验中，将样本分为液滴后进行PCR扩增，最终通过荧光检测器分析DNA拷贝数。

为了量化DNA降解速率，研究使用一级对数线性模型拟合实验数据，计算降解速率常数（k）和半衰期（T1/2）。此外，通过培养实验评估表面活性剂对微生物的抑制作用，目标包括绿藻、常见的细菌如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，以及酵母菌等。细胞活性通过MTT比色法测定，计算抑制浓度IC50。实验表明，这些表面活性剂对微生物和真核细胞均存在不同程度的毒性。

此外，研究还通过EtBr排除实验探讨了阳离子表面活性剂与DNA之间的相互作用。结果表明，不同表面活性剂均能影响EtBr与DNA的结合，进一步揭示了表面活性剂可能通过破坏DNA稳定性导致其降解。

实验结果使用GraphPad Prism软件进行统计分析，重点对不同处理组间的DNA浓度变化趋势进行对比。结果显示，表面活性剂对斑马鱼mtDNA的降解速率具有显著影响，且BAC、CPC和CTAB在不同浓度和作用时间下对环境和生物的毒性特性各不相同。

结果与讨论

实验结果表明，在未经处理的水中，mtDNA在30天内仅保留0.1%至1.8%。而在添加表面活性剂后，保存效果显著提高：经CTAB处理的水样qPCR检测显示30天后mtDNA的保留率高达26.3%，ddPCR则显示为51.8%。相比之下，CPC和BAC处理后的保留率分别为17.6%和2.2%（qPCR）及55.9%和13.5%（ddPCR）。这一差异表明，CTAB在eDNA保存方面具有显著优势，同时ddPCR的检测灵敏度和数据一致性优于qPCR，尤其在目标DNA浓度较低或质量较差的样本中。

通过线性回归分析发现，CTAB处理组的mtDNA降解速率最慢，呈现出显著的时间稳定性。在进一步的混合效应模型分析中，CTAB在短期和长期保存中的表现均优于其他处理组，这可能归因于其强大的DNA结合能力及抑菌特性。此外，CPC在短期保存中也表现出较好的稳定性，而BAC处理组则因其不稳定的保留率和较高的降解速率表现相对较差。研究还表明，与传统的现场水过滤方法相比，CTAB基的保存方法更为便捷高效，减少了交叉污染的风险，并显著提高了DNA的保存效果。

在对eDNA的降解速率分析中，通过假设一阶降解模型计算得出，不同处理组的降解速率常数和半衰期存在显著差异。CTAB处理组的日降解速率最低（qPCR为0.03，ddPCR为0.04），相应的eDNA半衰期最长（分别为21天和16.6天）。相比之下，未经处理的水样降解速率最高，半衰期最短（qPCR为4.2天，ddPCR为7天）。这些结果表明，CTAB和CPC能够显著延长eDNA的半衰期，从而为长期生态监测和环境评估提供了有效的解决方案。

阳离子表面活性剂的抗菌性能在eDNA保存中同样起到了关键作用。实验表明，0.01%的BAC、CPC和CTAB均能显著抑制细菌生长，处理后的水样中未检测到细菌增殖。这种强效的抗菌活性归因于阳离子表面活性剂分子与细菌细胞膜的相互作用，破坏了细胞膜的完整性，从而降低了微生物对eDNA的降解作用。此外，荧光光谱实验进一步验证了CTAB和CPC能够通过与DNA的静电作用和疏水相互作用形成稳定的复合物，从而保护DNA免受降解酶的破坏。

不过，该研究也指出，尽管阳离子表面活性剂在eDNA保存中表现出诸多优点，但其潜在的细胞毒性不容忽视。实验表明，BAC对HepG2细胞的IC50值最低，表明其毒性最高，而CPC和CTAB的毒性相对较低。这些结果提示，在实际应用中需合理选择表面活性剂的种类和浓度，以平衡其保存效果与生物安全性。

本研究系统评估了BAC、CPC和CTAB在eDNA保存中的效果，并证明了CTAB在延长eDNA保留时间、降低降解速率和提高抗菌活性方面具有显著优势。这为基于eDNA的生态系统监测和生物多样性评估提供了一种高效、便捷且稳定的保存策略。未来的研究可进一步优化表面活性剂的使用条件，并探索其在不同环境条件下的适应性和应用潜力，从而为全球生物多样性保护提供更坚实的技术支持。

感兴趣的“海洋与湿地”（OceanWetlands）读者可以参看全文：

Thamke, V., Bezabhe, Y.H., Jass, J. and Olsson, P.-E. (2024), Preservation of Aquatic Environmental DNA Using Cationic Detergents. Environmental DNA, 6: e70038.

学而思

思考题·举一反三