摘要：安徽农业大学 (School of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Anhui Province Key Laboratory of Crop Integrated Pest Managemen

研究论文

● 期刊：Advanced science(IF:14.3)

● DOI：

● 原文链接:

● 发表日期：2025-5-23

● 主要单位：

安徽农业大学 (School of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Anhui Province Key Laboratory of Crop Integrated Pest Management, Anhui Province Key Laboratory of Resource Insect Biology and Innovative Utilization, Hefei 230036, China)

南开大学 (College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin, 300071 China)

新加坡国立神经科学研究所 (Department of Neurology, National Neuroscience Institute, Singapore, 308433 Singapore)

摘要Abstract

自然界中的微生物以多样化的物种群落共存，彼此竞争空间和营养资源。然而，微生物之间以及它们与宿主之间调控网络的分子机制仍处于初步探索阶段。本研究利用整合的三物种模型系统，揭示了果蝇与共生菌植物乳杆菌结盟，共同抵御病原菌粘质沙雷氏菌的竞争。在双物种模型中，果蝇幼虫虽然减少了植物乳杆菌的数量，但通过转录重编程可逆地提升其乳酸产量。在三物种模型中，果蝇幼虫促进植物乳杆菌的生长，从而赋予其对粘质沙雷氏菌的定植抵抗能力。与此同时，粘质沙雷氏菌通过感知植物乳杆菌产生的乳酸，启动复杂的“军备竞赛”策略，削弱定植抵抗。更重要的是，在果蝇和植物乳杆菌的双重压力下，粘质沙雷氏菌群体适应性地分化为高毒力和低毒力亚群，伴随着抗性异质性的增加。为了与果蝇形成联盟，植物乳杆菌亚群之间的乳酸生成异质性也被显著加强。综上所述，我们的研究从群体和单细胞层面深入揭示了宿主-共生菌-病原菌三方共生关系，为精准调控细菌群落提供了新的理论基础和视角。

引言Introduction

大量的共生微生物群落终生定殖于个体的体内及其周围环境，对宿主的生理病理过程产生深远影响，包括发育、代谢、行为及疾病等方面。依赖于与宿主关系的微生物可分为互利共生菌、病原菌或共栖菌。大量证据表明，微生物组通过耗尽养分、占据生态位和调节免疫等机制，构筑了抵御病原菌入侵和定殖的常规屏障，这一现象被称为定殖抵抗。相反，病原菌则通过进化的军备竞赛策略，努力突破定殖抵抗。宿主内外两种拮抗微生物群体的长期共存通常保持稳定，但微生物间及其与宿主相互作用的分子机制仍不明朗。虽然物种间的相互作用受微生物群落组成的显著影响，环境波动通常发生在更短的时间尺度内，使得遗传突变或物种置换的可能性较低。微生物更多依赖快速启动复杂的转录重编程以适应环境变化。因此，微生物组被视为“受控生态系统”，其转录谱受到宿主调控和新菌株迁入的强烈影响。在此背景下，解析微生物组特征的主要挑战在于超越描述性组成水平的分析，深入解开微生物、宿主与病原菌间的转录互作网络。

病原菌已进化出多种防御策略以规避定殖抵抗。成功定殖主要依赖于在感染不同阶段精准调控毒力基因表达，以击败共栖菌的竞争。如果病原菌未能足够快速地表达毒力因子，便可能在达到最优毒力前被微生物组清除。然而，毒力基因的表达代价高昂，病原菌因此采用双稳态的抗性调控，导致群体内表现出表型异质性。在此情境下，病原菌以双稳态方式表达毒力因子，形成生长缓慢且毒力强的亚群与生长快速但毒力较弱的亚群。表型异质性被认为能加速细菌群体在极端环境风险下的适应性进化，通过快速产生具新表型特征的亚群降低灭绝风险。最新研究发现，即使在均一条件下，细菌也能随机分化为具有表型异质性的亚群，以规避灭绝风险。

然而，传统的群体RNA测序技术仅能获得细胞群体的平均基因表达，掩盖了微生物群体行为中隐藏的细胞间变异。幸运的是，细菌单细胞RNA测序技术的出现正在革新对单个细胞表型异质性的分析，为抗病原菌策略开辟新途径。例如，该技术有助于识别处于停滞期与指数生长期过渡阶段的持久细胞，推动对细菌致病机制的理解。哺乳动物体内组成物种的多样性及其时空转录动态，使得定殖抵抗成为复杂的表型。相比之下，果蝇体内含有低多样性的可培养菌群，便于系统解析多物种间的互作网络。在自然环境中，腐食性果蝇幼虫吞食持续被多样共栖菌和病原菌定殖的腐烂水果。与哺乳动物体内微生物的内部生长不同，果蝇通过频繁摄入环境细菌实现微生物组的重新定殖，形成开放式共生系统。因此，在此开放系统中，微生物的数量与质量对果蝇生命活动的影响远超封闭系统。尽管如此，许多基本机制和原理在脊椎动物、无脊椎动物、植物乃至部分单细胞宿主中具有普遍适用性。本研究结合混池和单细胞RNA测序技术，基于集成的果蝇-共栖菌-病原菌模型系统，探讨了果蝇共栖菌与病原菌的表型异质性，凸显了生态系统中三方关系的复杂性。

结果Result

果蝇幼虫调控植物乳杆菌乳酸代谢及其影响

果蝇幼虫通过分泌消化酶（如淀粉酶和蔗糖酶）促进植物乳杆菌乳酸的产生。尽管幼虫减少了植物乳杆菌的数量，但通过转录重编程使其乳酸产量可逆性增加(图1)。乳酸的积累导致培养基pH下降，形成不利于病原菌的环境，间接保护宿主免受病原菌侵害。

图1 | 果蝇幼虫刺激植物乳杆菌产生乳酸

(A) 不同处理组中植物乳杆菌数量变化；(B) PCA分析区分无幼虫（L组）与有幼虫（LF组）条件下的转录差异；(C) 差异表达基因数量统计；(D) 富集的功能通路（核糖体、转运系统、抗性相关通路等）；(E) 糖酵解通路关键基因表达上调；(F) 培养基中乳酸含量变化；(G) 培养基pH值变化；(H) 幼虫分泌消化酶促进乳酸生成的实验验证。

三物种共生模型中植物乳杆菌促进定植抗性

在包含果蝇幼虫、植物乳杆菌和粘质沙雷氏菌的三物种模型中，幼虫促进植物乳杆菌的生长和乳酸产量，增强其对粘质沙雷氏菌的定植抵抗(图2A)。粘质沙雷氏菌虽然生长速度较快，但在三方共存环境下，其数量和毒素产量均受到抑制(图2B-E)。

图2 | 三物种共生模型中细菌负荷与色素产量

(A) 不同接种比例下植物乳杆菌负荷变化；(B) 粘质沙雷氏菌负荷变化；(C) 不同条件下粘质沙雷氏菌色素产量变化；(D) 色素产量与细菌数量的关系分析；(E) 三方共存条件下色素产量显著降低；(F) 色素产量与细菌负荷的相关性。

病原菌粘质沙雷氏菌的代谢重编程与毒力调控

粘质沙雷氏菌在三方共存环境中表现出显著的转录调控，糖酵解通路下调，三羧酸循环（TCA）部分基因上调 (图3A-F)。乳酸不仅作为能量底物支持其生长，还作为信号分子诱导毒力基因表达(图3G,K)。脂多糖和肽聚糖合成及抗菌肽抗性通路被上调，增强其对宿主免疫和微生物竞争的抵抗能力(图3H-J)。

图3 | 病原菌粘质沙雷氏菌代谢重编程与毒力调控

(A) PCA及层次聚类分析显示四组样本基因表达差异；(B) 独特差异表达基因筛选；(C) 显著上调和下调通路富集分析；(D) 糖酵解通路基因表达变化；(E) 培养基中乳酸含量测定；(F) 培养基pH变化；(G) 乳酸作为唯一碳源支持粘质沙雷氏菌生长；(H) 脂多糖合成相关基因表达热图；(I) 肽聚糖合成相关基因表达热图；(J) 基因集富集分析（GSEA）；(K) 乳酸诱导毒力基因表达实验。

单细胞RNA测序揭示粘质沙雷氏菌群体内部存在明显的代谢和毒力基因表达异质性。细菌分化为16个亚群，不同亚群对应不同环境条件。无幼虫环境下糖酵解基因表达较高，含幼虫和植物乳杆菌环境中糖酵解基因表达下降且异质性增强；TCA循环基因则在含幼虫和植物乳杆菌的环境中表达增强(图4A-I)。带GFP报告基因的实验验证了代谢基因表达的异质性(图4J-L)。

图4 | 单细胞RNA测序揭示粘质沙雷氏菌代谢异质性

(A) 单细胞聚类图展示4个实验组分布；(B) 16个亚群详细划分；(C) 各亚群对应实验处理组；(D) Cluster 3糖酵解基因富集；(E) 糖酵解基因在不同亚群中的表达比例；(F) adhE、gapA、pgi基因表达差异；(G) TCA循环基因表达分布；(H) Cluster 11中TCA循环基因富集的GSEA分析；(I) 关键TCA循环基因在Cluster 11与5中的表达比例；(J) GFP报告基因pgi表达强度及分布；(K) GFP报告基因adhE表达强度及分布；(L) GFP报告基因sucA表达强度及分布。

在宿主和植物乳杆菌的压力下，粘质沙雷氏菌通过调节两组分系统基因（如cpxA、pmrB、uvrY）增强毒力(图5A)。Cluster 11亚群中，细胞壁合成、运动和分泌系统相关基因表达明显上调，表现出更强的适应能力(图5B-E)。乳酸促进了毒力基因secG的异质性表达。菌落大小分析显示，LFS组及乳酸处理后，耐药性异质性增加，部分细胞生长更快(图5F-G)。

图5 | 单细胞RNA测序揭示粘质沙雷氏菌抗性异质性

(A) 两组分系统基因表达；(B-C) 细胞壁合成基因表达；(D-E) 群体感应和分泌基因表达；(F-G) secG基因荧光强度和乳酸诱导异质性；(H-J) 菌落大小及耐药性异质性分析。

植物乳杆菌调节糖酵解异质性以适应宿主

植物乳杆菌在三方共存环境中糖酵解通路显著上调(图6A-B)。单细胞分析显示，幼虫和病原菌刺激下，糖酵解相关基因表达存在异质性，部分亚群表达更高(图6C-G)。乳酸产量增加与糖酵解异质性变化相关，表明植物乳杆菌通过调节代谢异质性参与对抗病原菌的联盟。

图6 | 果蝇幼虫刺激植物乳杆菌异质化乳酸表达合成

(A-B) 糖酵解通路富集及基因表达；(C-D) 单细胞转录模式聚类；(E-G) 糖酵解基因表达比例及异质性分析。

讨论Discussion

宿主通过多种机制监控共生菌，以最大化其益处。精准调控细菌群落需理解多物种生态动态。本研究发现，果蝇幼虫在病原菌存在时促进植物乳杆菌生长，并与其合作抑制粘质沙雷氏菌扩散。宿主通过类似“社会消化”的环境调节，促进共生菌生长，形成抗病联盟。植物乳杆菌作为优势菌迅速消耗优先碳源，限制其他细菌竞争，并发挥抗菌作用。单细胞转录组分析揭示植物乳杆菌亚群中乳酸生成存在异质性，表明共生菌参与联盟适应的转录调控。该模型简化了复杂微生物互作，有助于未来研究野生果蝇肠道生态。

粘质沙雷氏菌作为机会性病原菌，具备多种毒力因子和复杂策略以突破宿主防御。尽管被宿主和共生菌联盟抑制，其生长速度仍快于植物乳杆菌，并展现出代谢适应以规避营养竞争。乳酸不仅调节其生长，还诱导毒力基因表达。细菌单细胞RNA测序显示，粘质沙雷氏菌群体内存在毒力表达的表型异质性，部分亚群专门表达毒力因子以竞争共生菌。这种异质性也体现在抗生素敏感性上，提示开发针对持久细胞的精准治疗策略。鉴于部分亚群对定植抵抗具备耐受性，未来可探索靶向这些亚群的抑制剂联合乳酸或抗菌肽以提高病原菌清除效率。

综上，本研究构建了一个整合模型，揭示了宿主、共生菌与病原菌三方的复杂互作，拓展了单细胞层面内在调控网络的认识，为未来创新病原菌防控策略提供新思路(图7)。

图7 | 果蝇-植物乳杆菌-粘质沙雷氏菌的三物种互作模型

参考文献

S. Zhang, Z. Wang, A. Liu, J. Li, J. Zhuang, X. Ji, P. I. Mulama, M. Li, H. Cao, E.-K. Tan, W. Liu, Hosts and Commensal Bacteria Synergistically Antagonize Opportunistic Pathogens at the Single-Cell Resolution. Adv. Sci. 2025, e00582. https://doi.org/10.1002/advs.202500582

作者简介

第一作者简介

张晟

张晟，安徽农业大学博士研究生，主要研究宿主和微生物互作，细菌单细胞转录组，细菌宏基因组等。目前成果发表于Advanced Science, eLife等国际学术期刊上。

通讯作者简介

刘威

刘威，教授，博士生导师。1982年6月生，安徽农业大学高层次引进人才，山西省三晋英才获得者,中国昆虫学会微生物组专业委员会委员，多个专业期刊的审稿人。利用果蝇和黑水虻等昆虫进行微生态学基础和应用研究，综合运用分子、细胞、遗传、发育和神经生物学等主要技术，从事微生物对宿主发育、代谢、免疫、神经和行为等调节的基础研究。其研究成果发表在Nature Communications, Advanced Science, eLife, Translational Neurodegeneration，Human Molecular Genetics等国际学术期刊上，获得国家发明专利2项。

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来源：微生物组