摘要：结直肠癌作为消化系统最常见的恶性肿瘤之一，已成为全球癌症死亡的第四大原因。在我国，其发病率和死亡率在恶性肿瘤中排名分别位居第二和第五。尤为值得关注的是，结直肠癌患者发生肝转移的概率极高，在疾病进程中，约有50%的患者会出现肝转移，而70%的结直肠癌死亡病例更是

结直肠癌作为消化系统最常见的恶性肿瘤之一，已成为全球癌症死亡的第四大原因。在我国，其发病率和死亡率在恶性肿瘤中排名分别位居第二和第五。尤为值得关注的是，结直肠癌患者发生肝转移的概率极高，在疾病进程中，约有50%的患者会出现肝转移，而70%的结直肠癌死亡病例更是直接归因于肝转移。因此，肝转移的治疗成为了结直肠癌治疗领域的重点和难点。

2024年8月12日，中山一院匡铭教授团队与精准医学研究院尹长军研究员合作在结直肠癌肝转移免疫微环境领域取得重要研究进展，并于国际权威肿瘤学期刊Cancer Cell上发表题为CCL19-producing fibroblasts promote tertiary lymphoid structure formation enhancing anti-tumor IgG response in colorectal cancer liver metastasis的研究成果。该研究利用包括华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq在内的多种单细胞多组学测序技术、患者源性、与TLS相关的单克隆抗体以及人源化小鼠模型，深入探讨了三级淋巴结构（TLS）在结直肠癌肝转移（CRLM）中的分布特征及其临床意义，首次揭示了CCL19+成纤维细胞在TLS形成过程中的关键作用。更重要的是，研究证明了TLS能够在原位产生具有抗肿瘤功能的靶向肿瘤抗体，这一新机制为利用肿瘤内部TLS产生的抗体来增强抗肿瘤免疫开辟了新途径。这一发现不仅为深入理解CRLM的免疫学特性提供了宝贵见解，也为研发针对结直肠癌肝转移的诊断与治疗药物提供了创新思路。

三级淋巴结构（TLS）是一种异位淋巴滤泡，主要由B细胞、T细胞和髓样细胞构成。最新研究表明，TLS的存在与实体瘤患者对免疫治疗的积极反应及较长的总生存期（OS）之间存在紧密联系。不过，值得注意的是，TLS在各类癌症中的分布和构成存在差异，这可能导致不同的临床结果。对于结直肠癌肝转移（CRLM）的患者，转移性CRC细胞在肝脏中会遇到一个独特的微环境，但关于TLS在这种环境中的分布及其临床意义，目前研究的还不够深入。

B细胞作为TLS的重要组成部分，其运输过程对于揭示TLS形成的调控机制至关重要。以往的研究已经发现，T细胞或成纤维细胞产生的CXCL13能够吸引B细胞进入与肿瘤相关的TLS。此外，成纤维细胞产生的CCL19和CCL21也在自身免疫性疾病中促进了TLS的形成。然而，在CRLM中，B细胞是如何被募集到TLS的，目前仍然是一个未解之谜。B细胞和浆细胞（PC）通过产生抗体在体液免疫中发挥着至关重要的作用。这些抗体通过多种机制，如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、吞噬作用（ADCP）、补体依赖性细胞毒性和增强抗原呈递等，来发挥免疫功能。然而，在CRLM中，关于B细胞的募集及其生物学功能，我们目前知之甚少。

1. TLSs的分布和成熟度可作为CRLM患者的预后指标

研究针对178名结直肠癌肝转移（CRLM）患者的肿瘤组织切片，深入分析了三级淋巴结构（TLSs）的分布位置（瘤内iTLSs与瘤周pTLSs）及成熟度（未成熟淋巴细胞聚集体Agg与成熟淋巴滤泡FL）。作者认为瘤周与瘤内的iTLSs应视为一个整体研究单元，并据此提出新的肿瘤分级策略，将CRLM组织划分为TLS+与TLS-两类。其中，TLS+肿瘤指瘤内或瘤周含有成熟TLSs的肿瘤，而TLS-肿瘤则指瘤内无TLSs且瘤周仅含未成熟TLSs的肿瘤。通过对这两类患者生存期、复发生存期、预后效果及临床病理特征的关联性研究，发现成熟TLSs可作为CRLM患者良好生存期和预后的独立预测指标。

2. CRLM中TLSs的特征和功能

▶ 多组学测序研究揭示，在TLS+结直肠癌肝转移（CRLM）样本中，观察到B细胞功能的显著活化现象，同时，在瘤周区域以及TLS周边，IgG+浆细胞呈现出明显的聚集态势。

通过分析14例结直肠癌肝转移（CRLM）患者的Bulk RNA-seq数据，研究发现TLS+肿瘤中免疫球蛋白基因的表达水平显著提升，且差异基因主要富集于多种免疫激活途径，尤其是B细胞和CD8+ T细胞显著增多（图2. B-E）。进一步通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）探究TLS- CRLM、TLS+ CRLM及肝组织的细胞构成，结果显示浆细胞（PCs）在肿瘤免疫群体中占据主导地位；特别地，TLS+ CRLM中的PCs主要为IgG+型，而TLS- CRLM中的PCs则以IgA+型为主（图2. F-I）。

此外，scBCR-seq数据显示，在TLS+结直肠癌肝转移（CRLM）中IGHG1-4基因表达富集，而在TLS-CRLM中则是IGHA1-2基因表达富集。多重免疫组化（mIHC）技术进一步证实了瘤周区域及TLS附近IgG+浆细胞（PCs）的聚集现象（图3. A-C）。Stereo-seq的结果也表明，TLS周边IgG+ PCs的聚集更为显著，而IgA+ PCs则主要分布在非TLS区域（图3. D-F）。这种TLS+ CRLM与TLS- CRLM附近IgG+与IgA+ PCs分布差异的原因，可能归因于CRLM中B细胞在TLS内经历了IgG亚型转换及克隆扩增的过程（图3. G-M）。

▶ TLSs产生和分泌IgG抗体，通过增强巨噬细胞介导的抗肿瘤作用促进肿瘤凋亡

为了探究IgG是否具备抗肿瘤作用及其潜在机制，研究人员进行了多项实验。mIHC实验结果显示，TLS+肿瘤中的IgG信号更为强烈。同时，肿瘤周围的巨噬细胞相较于自然杀伤细胞（NK细胞）展现出更高的密度和更近的邻近性。此外，IgG+肿瘤中caspase-3的表达有所增加，这提示着凋亡过程的增强。Stereo-seq技术进一步揭示，与IgG+浆细胞（PCs）相邻的肿瘤细胞相比，与IgA+ PCs相邻的肿瘤细胞表现出凋亡通路富集的显著降低。这些综合结果表明，TLSs产生并分泌的IgG抗体很可能通过促进巨噬细胞介导的抗肿瘤作用来加速肿瘤细胞的凋亡过程（图4）。

▶ TLSs相关的PCs产生的单克隆抗体具有抗肿瘤作用

为了探究TLSs相关的浆细胞（PCs）是否能产生具有抗肿瘤活性的单克隆抗体（mAbs），研究者首先利用其BCR重链和轻链序列制备了20种人鼠嵌合单抗。通过对三名结直肠癌肝转移（CRLM）患者的肿瘤组织及配对肝脏组织进行免疫荧光（IF）染色，结果显示大多数mAbs能与肿瘤相关抗原结合，其中mAb6在肿瘤区域的结合活性最高（图5. A-D）。进一步地，利用这些mAbs对人类CRC细胞系（HCT116，HT29）与非癌细胞系（MIHA）进行流式细胞术和免疫荧光染色实验，发现mAb6、mAb7和mAb9能特异性地靶向结合CRC细胞系中共有的自身抗原（图5. E-G）。

为了验证这些mAbs的功能，研究者随后制备了全人源抗体，并通过抗体依赖型细胞吞噬（ADCP）实验证明部分抗体能够增强巨噬细胞的吞噬作用，从而发挥抗肿瘤效果（图5. I）。此外，通过在人源化小鼠中进行抗体治疗并评估肿瘤大小，研究者发现mAb6治疗两周后可显著抑制体内肿瘤的生长（图5. J-L）。这些结果充分表明，TLSs相关的PCs产生的单抗具有特异结合肿瘤保守抗原及抗肿瘤的作用。

3. CRLM中TLSs的形成机制

▶ CCL19+ 成纤维细胞促进B细胞募集和TLS形成

为了深入探究B细胞如何被吸引到肿瘤周边，作者首先分析了B细胞上已知的趋化因子受体表达水平，发现TLS+肿瘤中的B细胞高表达CCR7。接着，通过信号通路分析探究naive B细胞与其他细胞群体的相互作用，结果显示，在TLS-肿瘤中，F2_CAF与B细胞之间的CCL19-CCR7趋化因子轴缺失，这表明这一细胞间相互作用对于TLSs的形成至关重要（图6. A, B）。

为了评估CCL19表达水平与TLSs成熟度之间的关系，研究者发现TLS+区域的CCL19密度高于已知的TLSs趋化因子CXCL13，且CCL19在所有成熟阶段的TLSs中均有分布，而CXCL13仅在成熟的TLSs中表达（图6. C-E）。Stereo-seq技术进一步验证了这些趋化因子的空间分布模式，以CR2的表达作为TLSs成熟度的标志，发现CCL19在早期TLSs中表达更为丰富，而CXCL13则与TLSs的成熟阶段相关（图6. F, G）。这提示我们，CCL19可能在TLSs的早期形成阶段起主导作用，而CXCL13则在TLSs的晚期成熟阶段发挥作用。

进一步地，研究者确定了分泌CCL19的主要成纤维细胞亚群为C5_CAF_CCL19。他们发现，C5_CAF_CCL19亚群在F2_CAF中的占比与IgA+ PCs/IgG+ PCs的比例呈负相关，同时bulk RNA-seq数据分析也显示CCL19的表达水平与IGHA1/IGHG1的表达比例呈负相关（图6. H-J）。此外，C5_CAF_CCL19亚群比例的增加与IgG+ PCs比例的增加相关，这进一步提示了C5_CAF_CCL19亚群与TLSs形成之间的关联性。

最后，通过mIHC实验，研究者观察到TLS+肿瘤中存在CCR7+ B细胞被丰富的CCL19+成纤维细胞所环绕的结构，且随着CCL19+成纤维细胞密度的增加，CCR7+ B细胞和CCR7+ T细胞的密度也相应增加（图6. K, L）。这一发现进一步证实了成纤维细胞通过CCL19-CCR7轴促进B细胞的募集，从而参与TLSs的早期形成过程。

▶ CCL19治疗CRLM可促进TLS形成和抑制肿瘤生长

鉴于TLS+与患者良好的生存期紧密相关，且CCL19-CCR7轴在B细胞募集和TLSs形成中扮演关键角色，作者进一步探索了CCL19在治疗结直肠癌肝转移（CRLM）中的潜在应用，以及它是否能促进CRLM的治疗效果。

通过对CRLM小鼠模型实施CCL19治疗及阻断CCR7受体的CCL19治疗，研究者发现CCL19具有依赖于CCR7的抗肿瘤作用（图7. A-C）。此外，将CRLM小鼠模型分别接受单独CCL19治疗、单独CXCL13治疗及联合治疗进行对比，结果显示联合治疗的效果更为显著（图7. D, E）。

为了深入探究CCL19的来源，scRNA-seq数据表明，在CRLM中，CCL19不仅来源于F2_CAFs（成纤维细胞亚群），还来源于M7_cDC（树突状细胞亚群）（图7. F）。然而，mIHC实验的结果却指出，CCL19主要由F2_CAFs表达（图7. G）。Stereo-seq数据则全面展示了这些趋化因子的空间分布特征，并发现CCL19的表达与F2_CAF特征的相关性更高，特别是在TLSs内的成纤维细胞，它们比TLSs外的成纤维细胞表达更高水平的CCL19（图7. H-J）。这一发现表明，在治疗中起主要作用的CCL19主要是由TLSs内的成纤维细胞分泌的。

▶ CCL19是结直肠癌（CRC）患者生存期的一个潜在良好指标

作者继续深入探究了CCL19作为预测良好生存期标志物的潜力。通过分析公共转录组数据，他们发现高水平的CCL19与结直肠癌肝转移（CRLM）和结直肠癌（CRC）患者的更长总生存期显著相关。此外，CCL19的表达水平与TLS基因评分呈正相关，且与肿瘤的早期分期密切相关。这些结果表明，CCL19的表达水平有望成为评估CRLM和CRC患者生存期的潜在重要指标（图7. K-L）。

此研究致力于全面解析结直肠癌肝转移（CRLM）中的肿瘤相关淋巴结构（TLSs），并据此构建了一套详尽的TLS评估体系，实现了对CRLM患者的精准分层。研究者运用了包括华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq在内的多种单细胞多组学测序技术，结合患者来源的TLSs相关单克隆抗体及人源化小鼠模型，深入探究了TLSs在CRLM中的独特特性、关键功能及其形成机制。

研究揭示，TLSs的分布状态与成熟度是评估CRLM患者预后的重要指标。TLSs具备产生并分泌IgG抗体的能力，这些抗体通过增强巨噬细胞介导的抗肿瘤作用，有效促进了肿瘤细胞的凋亡。此外，CCL19+成纤维细胞在TLSs的形成中发挥着关键作用，它们通过募集B细胞并推动TLSs的成熟，从而显著抑制了肿瘤的生长。

本研究不仅深入剖析了CRLM中TLSs的形成机制，还详细阐述了其在肿瘤免疫微环境中的核心作用。这些研究成果为开发针对CRLM的新型治疗策略，以及提升患者的临床治疗效果提供了坚实的理论基础和实践指导。

来源：小金谈健康知识