摘要：斯坦福大学的研究团队近日在《Science》发表突破性成果：他们首次构建了可模拟人类神经中轴线发育的组装体类器官，利用人类干细胞衍生的底板类器官（hFpO）与脊髓类器官（hSpO）组装成“中线组装体类器官”，成功重现了底板在脊髓腹侧化及连合轴突导向中的作用，该
斯坦福大学的研究团队近日在《Science》发表突破性成果：他们首次构建了可模拟人类神经中轴线发育的组装体类器官，利用人类干细胞衍生的底板类器官（hFpO）与脊髓类器官（hSpO）组装成“中线组装体类器官”，成功重现了底板在脊髓腹侧化及连合轴突导向中的作用，该团队还发现了人类特异的底板富集基因在轴突导向中的关键调控作用。
文章介绍
题目：中线组装体类器官揭示人体轴突导向的调节因子
杂志：Science
影响因子：45.8
发表时间：2025年7月
#1
研究背景
Background
脊髓和底板是中线结构的重要组成部分，底板通过分泌SHH、Netrin-1等形态因子和轴突导向分子，促进神经管的发育和神经回路的形成，在神经管的形成和发育中起到关键的“组织者”作用。脊髓则负责传递神经信号，确保运动和感觉功能的协调。
然而，当前一直存在几个瓶颈问题：人源底板类器官的缺失；底板-脊髓互作机制空白；人类特异导向基因未知。
#2
研究思路
Methods
成功构建两种关键的类器官模型：hFpO和hSpO；对应不同的研究目的，创新性地设计了两种不同的组装体系统。
为了深入解析这些类器官的分子特征，采用了多组学分析策略。
通过CRISPR功能筛选锁定"人类特异"的候选基因，对关键基因进行了深入的功能验证。
功能验证：轴突追踪与形态验证、双侧同步性验证等。
#3
关键技术
Key Technology
1. 底板类器官和脊髓类器官的构建
将人诱导多能干细胞聚集体暴露于一系列的生长因子和小分子组合以模拟由脊索驱动的底板诱导；脊髓类器官在同样双SMAD抑制基础上刻意去掉SHH信号，从而维持背侧脊髓特性。
2. 两种不同的组装体
腹侧模式诱导中线组装体，使用Day 8的脊髓类器官和Day 8的底板类器官。
轴突导向组装体的生成，采用的是Day 22的成熟脊髓类器官和Day 8的底板类器官组合。
#3
研究结果
Results
1. 底板类器官与脊髓类器官的构建与表征
通过双SMAD抑制+SAG/FGF2/CHIR/RA诱导hiPSC聚集体，8天内高效生成85%FOXA2⁺人底板类器官，hFpO呈玫瑰花样并表达典型底板基因（补充图1）。
补充图1
与hSpO相比，hFpO条件培养基显著促进小鼠背侧脊髓外植体轴突生长，显示其分泌活性（图1）。
图1
hFpO类器官可高效模拟早期人类底板的三维结构与分子特征，为神经发育研究提供可靠模型（图1）。上述结果表明，利用干细胞可稳定高效地生成在三维结构上模拟早期人类底板的类器官培养体系。
图1
2. 构建hMA以模拟底板诱导的腹侧模式形成
中线组装体类器官成功模拟了体内底板对脊髓腹侧模式的调控，为研究神经管发育提供了高度仿生模型；SHH是hFpO诱导腹侧化的核心介质，其抑制可完全阻断该过程，与已知发育生物学机制一致（图2）。
图2
SHH信号必须直接通过hSpO自身的SMO介导才能诱导腹侧化，而hFpO的FOXA2表达不受影响，排除了hFpO间接调控的可能性（补充图4）。
补充图4
未组装的hSpO表达背侧转录因子，而组装的hSpO表达腹侧转录因子。组装hSpO中富集SHH通路激活标记GLI1，而未组装hSpO富集SHH通路抑制标记GLI3（图2）。
以上结果表明，底板类器官通过SHH-GLI信号轴驱动脊髓类器官的腹侧化，重现了胚胎脊髓发育中底板作为组织者的功能。
图2
3. 构建hMA以模拟轴突导向
晚期阶段无SHH条件下，hSpO成功生成富含ROBO3⁺/DCC⁺投射型连合中间神经元的背侧脊髓细胞簇，为后续轴突导向实验奠定细胞基础（图3）。
图3
ROBO3在hSpO中呈现时间依赖性表达模式，而TUBB3表达则随时间持续增加，表明连合神经元的特异性导向功能与其整体神经元成熟过程协同发展（图3）。
图3
hiPSC来源的hSpO连合神经元能定向投射至hFpO，证实中线组装体类器官可模拟体内轴突导向的分子机制（图3）。以上结果表明，中线组装体类器官可复现人类底板依赖的连合轴突导向。
图3
4. 构建三部分hMA以模拟双侧神经连接
将hFpO夹在两个第22天的hSpO之间，形成仿生中线结构，组装成功率高达95.65%（图4）。
图4
有hFpO时轴突穿过中线并到达对侧，而无hFpO时几乎无跨中线行为；hFpO维持了丰富的FOXA2⁺底板细胞特性，并支持ROBO3⁺轴突成束化，与eYFP标记的投射共定位（图4）。
图4
含hFpO的组装体中双侧神经元出现同步钙爆发（显著相关性），而单独hSpO呈异步活动（图4）。
图4
融合后第10天，含hFpO的组装体中可见明显轴突投射，而hSpO中线对照几乎无投射；480 nm光遗传刺激在含hFpO的hMA中诱导出显著的对侧激活，而缺乏FP细胞的hMA反应显著减弱（补充图8）。
以上结果表明，三部分中线组装体类器官可用于模拟底板进入、穿越、出口及早期双侧功能性连接，为脊髓发育和修复研究提供了高仿生平台。
补充图8
5. CRISPR筛选揭示人类底板依赖性轴突导向的调控因子
比较人类与小鼠底板的表达保守性和差异性，10.5%的非必需基因表达差异超过10倍，其中EFEMP1、TTR和CLSTN3三个基因在人类底板中特异表达（补充图9）。
补充图9
建立KO hiPS细胞池，编辑效率>75%，用于评估连合轴突投射。NTN1与SPON1缺失均减少了ROBO3⁺轴突向hFpOs的投射；NRP2缺失对人类连合轴突导向无显著影响；GALNT2和PLD3缺失后明显减少连合轴突投射（图5）。
图5
GALNT2 KO降低了FOXA2的转录与蛋白水平，而PLD3缺失不影响底板身份（补充图10）。
补充图10
CRISPR突变体的eYFP⁺轴突向hFpOs的外生量显著降低，导向缺陷源于轴突外生减少，而非ROBO3表达丢失（补充图12）。以上结果表明，中线组装体类器官可用于鉴定功能重要的人类富集FP基因。
补充图12
小结
该研究开发了hFpO，并将其与hSpO结合构建“hMA”，用于研究人类神经发育中的中线组织机制。研究发现hFpO具有促进腹侧模式形成、引导连合轴突生长和建立双侧神经连接的功能。
通过分泌组分析和CRISPR筛选，鉴定出27个人类特有基因（相比小鼠），并发现GALNT2和PLD3基因缺失会损害底板对轴突的引导作用。
该平台为研究人类特异性神经生物学机制和疾病提供了新工具。
参考文献
Onesto MM, Amin ND, Pan C, et al. Midline assembloids reveal regulators of human axon guidance. Science. 2025;389(6757):282-289. doi:10.1126/science.adq7934
来源：老李说科学
