摘要：在探索生命奥秘的过程中，研究人员一直试图通过更高分辨率的显微技术窥探细胞内部的动态结构。然而，传统显微镜因光的衍射限制，无法清晰地分辨200纳米以下的细胞特征，这极大限制了人们对亚细胞结构的理解。近年来，超分辨率显微技术的出现，突破了这一瓶颈，成为细胞生物学研
在探索生命奥秘的过程中，研究人员一直试图通过更高分辨率的显微技术窥探细胞内部的动态结构。然而，传统显微镜因光的衍射限制，无法清晰地分辨200纳米以下的细胞特征，这极大限制了人们对亚细胞结构的理解。近年来，超分辨率显微技术的出现，突破了这一瓶颈，成为细胞生物学研究的重要工具，其中尤以结构化照明显微镜（SIM, Structured Illumination Microscopy）因其兼容性强、毒性低、速度快的优势备受瞩目。
尽管如此，SIM技术的分辨率仍具有一定的局限性，尤其是在轴向分辨率（z轴方向）上的不足，导致许多细胞的细微三维结构无法清晰呈现。为解决这一问题，研究人员开发了一种全新的显微成像技术——4Pi-SIM。这项技术通过结合3D-SIM与干涉显微术，成功实现了三维各向同性的100纳米分辨率，使研究人员能够在纳米尺度下清晰观察细胞内部的复杂结构和动态行为。（12月23日Nature Methods “Elucidating subcellular architecture and dynamics at isotropic 100-nm resolution with 4Pi-SIM”）
4Pi-SIM的核心技术在于利用六束相干光的干涉效应，同时在照明和检测波前中引入干涉，使得图像的分辨率在x、y和z轴方向上均达到前所未有的精度。这种设计不仅能够在固定细胞样本中分辨出微米级复杂网络，还能实时捕捉活细胞中快速发生的分子交互和细胞器动态。更重要的是，该技术支持双通道成像，可以同时记录不同细胞结构之间的相互作用。
显微镜的分辨率极限：为何我们看不清细胞的微观世界？
我们对于细胞内部的认知就像在浓雾中探寻美丽的风景，虽见其轮廓，却难窥细节。这一局限的核心在于光的物理特性：光的衍射效应（diffraction limit）决定了传统光学显微镜的分辨率极限，即约200纳米（nm）。换句话说，比这更小的结构将无法在显微镜下清晰呈现。这一限制在宽场显微镜（Wide-Field Microscopy, WF）中尤为显著，使得研究人员难以准确区分复杂的亚细胞结构，如微管、线粒体等。
这看似遥远的200纳米极限，其实与生命活动的核心息息相关。细胞中的许多关键活动，例如信号转导、蛋白质运输和细胞器相互作用，都发生在比200纳米更小的空间内。例如，细胞骨架中的微管直径仅约25纳米，而线粒体的动态膜结构变化也常在数十纳米的尺度下进行。对这些结构的模糊观察不仅阻碍了基础生物学研究，还限制了疾病诊断和治疗的深入探索。
为突破这一瓶颈，超分辨率显微技术（Super-Resolution Microscopy）应运而生。这些技术通过巧妙设计的光学路径和算法，成功将分辨率提高到几十纳米甚至更低。其中，结构化照明显微技术（SIM）是一种兼具高分辨率和低毒性的创新方法，使分辨率在横向（x轴和y轴）达到约120纳米。然而，SIM的轴向（z轴）分辨率仍然较弱，约为300纳米，导致三维图像中的细节失真。
从3D-SIM到4Pi-SIM：跨越分辨率的技术革命
在显微成像领域，3D结构化照明显微技术（3D-SIM）已经是一项重要突破。它通过将多个光学干涉图案叠加在样本上，成功将分辨率提高到横向约120纳米（nm）、轴向约300纳米的水平。然而，3D-SIM的分辨率仍存在明显的各向异性问题：轴向分辨率远逊于横向分辨率，导致成像时三维结构常被拉长或失真。这种不足，使研究人员在观察细胞亚结构时难以获得完整而准确的三维信息。
为了弥补这一缺陷，研究人员提出了4Pi-SIM技术，这是一种结合干涉显微术与3D-SIM的全新成像方案。4Pi-SIM的核心突破在于利用六束相干光束实现了照明和检测波前的双重干涉，使得分辨率在三维空间中达到近乎完美的各向同性——约100纳米。这一技术不仅解决了轴向分辨率不足的问题，还显著提高了整体成像的清晰度和精度。
相比3D-SIM，4Pi-SIM在光学设计上进行了革命性的升级。例如，采用水浸式物镜（水的折射率与生物样本更接近）代替传统油浸物镜，大幅减少了相位误差。此外，4Pi-SIM通过精确调整光学路径长度差（OPLD），实现了干涉条纹的最佳对比度，确保了长期成像的稳定性。更重要的是，其创新的双通道检测模块能够同时捕获两组相位互补的图像，为后续的计算重建提供了精准的数据支持。
实验表明，4Pi-SIM的分辨率远超3D-SIM。例如，在固定的COS-7细胞中，4Pi-SIM将微管的轴向分辨率提升至101.7±6.2纳米，比3D-SIM的320.7±17.6纳米精细了三倍。在观察线粒体网络时，4Pi-SIM不仅清晰显示了膜结构的中空特征，还捕捉到了3D-SIM难以分辨的复杂拓扑关系。
从3D-SIM到4Pi-SIM，这不仅是分辨率上的跨越，更是显微成像技术的一次全新革命。
4Pi-SIM原理与分辨率表征的结果（Credit:Nature Methods）
4Pi-SIM的光学设计和干涉原理（图a）：
简化示意图展示了4Pi-SIM的关键结构和工作流程。六束部分相干的照明光束在样本平面上产生干涉图案（蓝色）。样本发出的荧光信号（绿色）通过两个物镜（OBJ1和OBJ2）同时收集，并在非偏振分束器（NPBS）中进行相干组合，生成两幅相位互补的图像（xy和xz截面）。频域图显示，每个横向SIM方向包含19个照明成分，同时检测光学传递函数（OTF）在轴向上显著扩展。这些成分的卷积产生了一个高效的4Pi-SIM OTF，实现了极高的分辨率。
不同显微成像模式的横向分辨率对比（图b）：
使用100纳米荧光珠成像的横截面图，分别展示了宽场显微镜（WF）、3D-SIM和4Pi-SIM的横向分辨率。4Pi-SIM的分辨率显著优于WF，与3D-SIM相当。
轴向分辨率的提升（图c、d）：
轴向截面图显示了不同模式下轴向分辨率的差异。4Pi-SIM在轴向上展现了清晰的分辨率优势，其OTF实验测量结果也证明了这一点。
轴向分辨率的定量分析（图e）：
使用荧光珠的轴向强度分布曲线显示，4Pi-SIM相比3D-SIM和WF具有更好的光学切片能力，其轴向分辨率显著提升。
定量分辨率对比（图f、g）：
在100纳米荧光珠上测量的全宽半高（FWHM）数据显示：横向分辨率：WF为246.7±4.3纳米，3D-SIM为107.7±4.7纳米，4Pi-SIM为108.1±4.0纳米。轴向分辨率： WF为561.6±10.9纳米，3D-SIM为322.9±16.9纳米，4Pi-SIM为102.2±4.6纳米。在免疫标记的COS-7细胞微管中测量的结果表明，4Pi-SIM的分辨率在固定样本中同样表现出色：横向为104.4±5.0纳米，轴向为101.7±6.2纳米。
三维各向同性分辨率的实现：突破性设计的秘密
4Pi-SIM的核心突破在于实现了100纳米级的三维各向同性分辨率，这归功于其巧妙的光学设计与先进的干涉技术。传统显微镜的分辨率受限于单一物镜的数值孔径（NA），尤其在轴向（z轴）分辨率上难以匹敌横向（x轴和y轴）的精度。而4Pi-SIM通过引入六束光的干涉效应，打破了这一限制，为高分辨率三维成像开辟了全新路径。
4Pi-SIM采用两个相对放置的物镜，在样本的上下两侧同时作用，通过每个物镜生成三束相干光。六束光在样本平面交汇并产生干涉条纹，这种干涉效应极大提升了轴向分辨率。同时，样本发出的荧光信号被两侧物镜同时捕捉，并在非偏振分束器（NPBS）中进行相干组合，生成两幅互为相位补偿的图像。这一设计扩展了检测光学传递函数（OTF）的覆盖范围，使分辨率在三维空间中保持一致。
为了实现最佳的干涉效果，研究人员对4Pi-SIM的光学路径进行了精密调整。通过重新设计光程长度差（OPLD）调节模块，4Pi-SIM能够迅速且精确地将路径差调至零，以确保干涉条纹的对比度达到峰值。此外，采用水浸式物镜代替油浸物镜，有效减少了折射率不匹配带来的相位误差。这些改进使得系统能够长时间保持干涉腔的稳定性，即使在活细胞成像中也能提供高质量的图像。
实验数据也充分证明了这些设计的有效性。在测试中，4Pi-SIM对100纳米荧光珠的成像显示，其轴向分辨率为102.2±4.6纳米，是3D-SIM的三倍精细。这种超高分辨率不仅能在固定样本中清晰分辨复杂的亚细胞结构，还能捕捉活细胞中快速发生的动态行为。
固定细胞的高清视界：重新定义亚细胞结构
在细胞生物学研究中，固定样本的成像分析是揭示细胞亚结构的重要手段。然而，传统显微技术对复杂结构的分辨力有限，往往导致细节的模糊或失真。而4Pi-SIM的出现，彻底颠覆了这种局面，为固定细胞的高清成像开启了新篇章。
在研究线粒体结构时，4Pi-SIM展示了其惊人的解析力。研究人员对固定的HeLa细胞进行成像，成功捕捉到线粒体外膜的精细网络。这些网络在4Pi-SIM下展现出清晰的中空结构，而3D-SIM由于轴向分辨率不足，只能观察到模糊的轮廓，甚至完全丢失了膜的中空特征。相比之下，宽场显微镜（WF）更是难以辨别任何细节。
此外，在研究细胞骨架时，4Pi-SIM同样展现了无可比拟的优势。研究人员对COS-7细胞中的波形蛋白（vimentin）进行免疫标记后成像，发现4Pi-SIM能够分辨出纤维状波形蛋白网络的交织结构。而在3D-SIM下，这些纤维网络因轴向拉伸效应被误认为是连接在一起的连续结构。4Pi-SIM的精细成像为研究波形蛋白的空间组织及其在细胞功能中的作用提供了全新视角。
4Pi-SIM在神经元的固定样本中揭示了周期性膜骨架结构的细节。例如，在培养的原代神经元中，研究人员利用4Pi-SIM成功观测到βII-spectrin的周期性结构，其间距约为194纳米。这一发现不仅与以往研究结果一致，还进一步证实了4Pi-SIM在观察精细周期性结构方面的可靠性。
通过这些实例，4Pi-SIM重新定义了固定细胞的亚结构成像标准，其高清视界为细胞结构的研究打开了一扇前所未有的窗口，为深入理解细胞功能和机制提供了不可替代的工具。
活细胞动态行为的揭秘：从分子交互到细胞器运动
在显微镜下观察活细胞动态，宛如凝视生命的舞台，细胞器的运动与分子间的交互像舞者般交织。而4Pi-SIM的诞生，为这一舞台提供了前所未有的高清视角，使研究人员能够以三维各向同性的100纳米分辨率，捕捉活细胞内瞬息万变的动态过程。
研究人员利用4Pi-SIM对HeLa细胞中的线粒体动态行为进行了详细观察。实验中，线粒体外膜蛋白TOM20和OMP25被标记后，4Pi-SIM成功记录了线粒体网络的实时重组过程。在成像中，一个杆状线粒体逐渐变形为凹盘状结构，展示了线粒体膜结构动态调整的全过程。此外，研究还捕捉到线粒体生成纳米隧道的现象，这些直径从600纳米减小到150纳米的细丝连接不仅揭示了线粒体网络的复杂性，也表明了其在细胞内信息传递中的重要作用。
在另一个实验中，研究人员聚焦于COS-7细胞的细胞骨架动态行为。他们利用4Pi-SIM观察到微管的生长过程，清晰呈现了微管尖端在拥挤的网络中延伸的细节。同时，通过标记肌动蛋白（actin），研究发现细胞内的肌动蛋白束快速重排，并在伪足（filopodia）内形成疏松结构。这些动态行为的捕捉，为理解细胞运动和内吞作用提供了重要线索。
4Pi-SIM的优势不仅体现在其分辨率上，更在于其高速度和低光毒性使其能够长时间记录活细胞的动态变化。例如，实验中实现了300次时间点的成像，捕捉了内质网（ER）纳米孔形成和薄片向管状结构转变的全过程。这些复杂的动态过程，以往难以用传统显微镜技术观察。
双通道成像：捕捉多样细胞器的“对话”
在细胞的微观世界中，细胞器之间的相互作用宛如一场复杂而有序的“对话”。4Pi-SIM的双通道成像功能，为研究人员提供了一种前所未有的方式，以同时观察多个细胞器之间的互动动态，揭示其功能联系的精妙机制。
传统多色显微技术通常需要切换激光或滤光片，不仅增加了光毒性，还因时间延迟而无法同步捕捉快速发生的交互。而4Pi-SIM通过一个激光波长实现双颜色通道成像，巧妙解决了这一难题。研究人员采用了一种大斯托克斯位移（Large Stokes Shift）的荧光蛋白dCyOFP2，与常规绿色荧光蛋白oxStayGold相结合。通过单波长激发，这两种蛋白分别发射出不同波长的荧光信号，并在探测路径上被分光投射到相机的不同区域。这样的设计实现了多通道图像的同步捕捉，极大提升了成像效率与精确度。
在实验中，研究人员通过标记内质网（ER）和线粒体，成功记录了两种细胞器之间的接触和协同运动。例如，在HeLa细胞中，4Pi-SIM清晰显示了ER微管与线粒体纳米隧道之间的接触区域，并捕捉到了这些接触点处线粒体的融合与分裂过程。更令人惊叹的是，研究发现ER管状结构的运动往往标志着线粒体纳米隧道的起始位置，这一观察为理解ER在线粒体动态调控中的作用提供了直接证据。
除了ER和线粒体，研究还使用双通道成像探索了ER与微管网络的复杂交互。在COS-7细胞中，4Pi-SIM揭示了ER与微管的交织动态，并观察到两者的快速重组，这一过程可能是细胞内物质运输和结构维持的关键。
4Pi-SIM的双通道成像功能，不仅让细胞器的“对话”更加清晰生动，也为研究这些交互在生物过程中的具体作用提供了全新视角。
未来的应用场景：从基础研究到医学诊断
4Pi-SIM技术的问世为生命科学和医学领域打开了崭新的大门，其超高分辨率和动态成像能力，为解决许多长期未解的科学难题提供了可能。在未来，4Pi-SIM将不仅仅是显微成像的工具，更可能成为基础研究和医学诊断的核心利器。
在基础研究方面，4Pi-SIM能够以前所未有的清晰度呈现细胞的三维结构和动态行为。例如，细胞骨架的重组、线粒体的融合与分裂、内质网的动态重塑等关键生物过程都可以在纳米级分辨率下被全面解析。这些高精度的成像数据，将帮助研究人员进一步理解细胞功能的分子机制，并推动对细胞生物学基础规律的认知。
4Pi-SIM在医学研究中的潜力同样令人期待。在癌症研究中，4Pi-SIM可用于精确观察肿瘤细胞的亚细胞结构和细胞器间的相互作用，为癌细胞侵袭和转移机制的研究提供直接证据。在神经科学中，它能够揭示神经突触的微观变化以及与神经退行性疾病相关的结构异常。此外，通过多通道成像技术，4Pi-SIM还可以实时追踪病原体与宿主细胞的相互作用，为传染病的防治研究提供独特的视角。
更进一步，4Pi-SIM可能会在临床诊断中发挥作用。结合活细胞成像的能力，该技术可以用于检测活体样本中的细胞动力学变化，例如癌细胞的异常运动或病原体感染的早期反应。这种实时动态检测的能力，有望为疾病的早期诊断和个性化治疗提供支持。
技术的挑战：4Pi-SIM离极致还有多远？
尽管4Pi-SIM在分辨率和动态成像能力上取得了革命性突破，但要真正达到“极致”，仍需应对一些技术挑战。每一项挑战背后，既隐藏着局限，也蕴藏着机遇。
首先，4Pi-SIM的样本厚度限制是一个重要瓶颈。当前技术只能对厚度小于10微米的样本实现高质量成像，主要原因在于宽场照明的背景信号会淹没聚焦信号，显著降低图像对比度。同时，样本内的折射率异质性会引发光学像差，干扰干涉图案的精确性，最终导致图像质量下降。未来，通过引入光片照明或自适应光学技术，研究人员有望突破这一深度限制，拓展4Pi-SIM在厚样本和组织成像中的应用。
其次，活体成像中的长期稳定性仍然是一个难题。4Pi-SIM依赖于两个物镜间的干涉，这对光学路径长度差（OPLD）的精确控制要求极高。然而，空气扰动和温度变化常导致干涉对比度的下降，从而影响图像质量。虽然研究人员已开发出实时OPLD调整算法，但仍需进一步优化自动化反馈系统，以支持更长时间的成像稳定性。
此外，4Pi-SIM在多通道成像中的性能有待进一步提升。目前，长斯托克斯位移荧光蛋白的选择有限，且其荧光特性尚不如传统荧光探针理想。研究人员或许可通过开发新型荧光探针或改进多相机设计，实现更高效的多色成像，从而更全面地捕捉细胞器间的复杂交互。
最后，数据处理和图像重建的复杂性也是一大挑战。4Pi-SIM生成的数据量庞大，对计算资源和算法效率提出了极高要求。未来，结合深度学习算法的去噪和超分辨能力，将有助于加速图像重建过程，同时进一步提升图像质量。
尽管面临这些挑战，4Pi-SIM的前景依然充满希望。随着光学设计、探针开发和计算技术的持续进步，这一技术不仅可能接近“极致”，还将不断拓宽我们对细胞微观世界的认知边界。
参考文献
Ouyang, Z., Wang, Q., Li, X. et al. Elucidating subcellular architecture and dynamics at isotropic 100-nm resolution with 4Pi-SIM. Nat Methods (2024). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02515-z
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来源：小茵看科技
