摘要：单位：1.安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所；2.安徽省农业科学院园艺研究所；3.农业农村部园艺作物种质创制与利用重点实验室（部省共建）；4.园艺作物种质资源创制与高效栽培安徽省重点实验室
单位：1.安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所；2.安徽省农业科学院园艺研究所；3.农业农村部园艺作物种质创制与利用重点实验室（部省共建）；4.园艺作物种质资源创制与高效栽培安徽省重点实验室
简介：潘锐，女，安徽舒城人，助理研究员，硕士，从事植物病害防治研究。*通信作者，副研究员，硕士，从事植物病害检测及防治研究；高正辉，研究员，硕士，从事果树栽培与育种研究。
基金项目：农业农村部园艺作物种质创制与利用重点实验室（部省共建）项目；国家梨产业技术体系专项（CARS-28）；安徽省农业科学院平台项目（2023YL015）；安徽省果树产业技术体系（皖农科函〔2021〕711号）；园艺作物种质资源创制与高效栽培安徽省重点实验室项目（皖科基地秘〔2023〕430号）。
来源：《安徽农业科学》2024年23期
引文格式：潘锐,徐会永,臧昊昱,等.果生刺盘孢菌LFD-RPA可视化快速检测方法的建立[J].安徽农业科学,2024,52(23):136-139.
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果生刺盘孢菌（Colletotrichum fructicola）是一种常见的植物致病菌，可侵染咖啡属、柑橘属、梨属、杧果属、苹果属等多种植物，且具有广泛的地域和物种多样性，在世界范围内均有危害报道。梨炭疽病是由刺盘孢属真菌（Colletotrichumsp.）引起的，相关研究表明我国梨炭疽病的病原菌有12种，其中，果生刺盘孢菌为优势种。虽然梨炭疽病的病原鉴定已经取得一些进展，但仅仅依赖形态学特征辨别、PCR分子检测以及单基因构建系统发育树等方法均易受到人为因素和环境条件的干扰。此外，上述鉴定方法需要专业技术人员和特殊仪器设备，检测程序烦琐、耗时长，不符合快速检测的要求。因此，建立快速简便的方法对由果生刺盘孢菌引起的病害进行检测和早期预警具有现实意义。
重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）技术是一种在恒温条件下进行短时（5~20min）反应就可以扩增出靶标片段的核酸扩增技术，具有快速、灵敏、特异性高、操作简便等特点，已经成功应用于多种病原真菌、细菌、病毒和线虫等的检测。同时，RPA技术与侧流层析试纸条（lateral flow dipsticks，LFD）相结合，可实现检测结果的可视化，大大提高了该检测技术的实用性并且扩大了适用范围，但该结合技术对果生刺盘孢菌的检测应用尚少见报道。
目的
建立针对果生刺盘孢菌（Colletotrichum fructicola）的快速、准确、简便的检测方法，从而尽早对梨炭疽病采取防治措施，实现提高防控效果，减少损失的目的。
方法
根据果生刺盘孢菌的基因序列设计了特异性检测引物和探针，依据基因组聚类分析方法建立重组酶聚合酶扩增与侧流层析试纸条（LFD-RPA）相结合的可视化快速检测果生刺盘孢菌的方法。供试菌株见表1。
结果
◆检测特异性验证
为验证该研究中所设计的引物和探针组合物及检测体系的特异性，从表1所示菌株中选取2株果生刺盘孢菌株和9种不同的炭疽病病原菌进行LFD-RPA检测，并根据LFD试纸条的条带判断待测样品是否含有果生刺盘孢菌。当LFD试纸条出现一条蓝色条带位于质控区内，一条红色条带位于检测区的情况，则结果为阳性，表明待测样品中含有果生刺盘孢菌；当LFD试纸条质控区内只出现一条蓝色条带，则结果为阴性，表明待测样品中不含有果生刺盘孢菌。
特异性检测结果如图1所示，只有2株果生刺盘孢菌的检测区出现红色目的条带，其他同属不同种的炭疽病菌与阴性对照均只出现蓝色的质控条带，说明该研究中，基于果生刺盘孢菌的基因序列设计的引物和探针具有种间特异性，可以用于区分果生刺盘孢菌与炭疽病菌的其他种，且检测结果肉眼可见，无需借助任何仪器，检测过程中操作简便、反应迅速便于基层检验检疫。
图1 LFD-RPA特异性检测结果
◆检测灵敏度验证
为评估该研究中设计的引物探针组合的检测灵敏度，利用系列梯度浓度为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL的果生刺盘孢菌的基因组DNA进行LFD-RPA检测。结果如图2所示，当基因组DNA浓度为1pg/μL时即可检出病原菌，表明该研究中LFD-RPA技术体系具有较高检测灵敏度。
图2 LFD-RPA灵敏度检测结果
◆检测适用性验证
为了验证该研究所建立的LFD-RPA检测方法的实际应用情况，采用人工接种方法诱导果实发病，分别使用发病组织的DNA提取物及发病组织的无菌水研磨液作为检测样本，利用该研究设计的引物及探针组合物，进行LFD-RPA检测。结果如图3所示，由果生刺盘孢菌引起的果实病样的总核酸及研磨液的检测结果为阳性，其他病害样品和健康样品的检测结果为阴性，说明该研究所建立的LFD-RPA检测技术体系能够成功应用于梨病害样品中果生刺盘孢菌的检测分析。同时，该技术体系可直接将无菌水研磨液作为检测样本，大大简化了检测流程，更适宜于基层田间检测应用，体现了LFD-RPA检测技术的优势。
注：1~4为被Colletotrichum fructicola、Alternaria alternata、Botryosphaeria dothidea侵染的梨病害样品及健康样品的DNA，5~8为被C.fructicola、Alternaria alternata、侵染的梨病害样品及健康样品的组织研磨液。
图3 LFD-RPA检测病害样品
◆田间应用验证
收集不同来源的梨病叶或梨病果样品，进行表面消毒处理后，加入无菌水进行研磨，以其研磨液为模板，利用该研究设计的引物及探针组合物，按照LFD-RPA检测体系及方法进行检测，同时以果生刺盘孢菌的DNA作为阳性对照，用等量无菌水替换模板DNA作为阴性对照。结果如图4所示，7份病样中有5份样品显示果生刺盘孢菌存在，与常规病原菌分离鉴定的结果一致。同时笔者对病样进行病原菌分离时发现有其他炭疽病菌与果生刺盘孢菌共存现象，说明该检测体系可以排除其他病原菌干扰，准确检测出果生刺盘孢菌。
图4 LFD-RPA检测田间病害样品
结论
该检测方法与其他病原菌无交叉反应，特异性强，且检测灵敏度达1pg/μL，可从不同的植物病原细菌中特异性地检测到参试果生刺盘孢菌；无需 PCR 仪等复杂设备，在39℃恒温反应12min 即可完成检测过程，对模板的制备要求低，操作简便，不需要贵重仪器设备，既摆脱了传统分子检测耗时耗力及设备昂贵和反应条件的严格限制，同时检测结果肉眼可见，更适合于基层条件不足的植保植检部门用以进行病害检测，在果生刺盘孢菌的检验检测、田间诊断、辅助鉴定和早期预警等方面具有较高的潜在应用价值。
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采编：小白
排版：小同
来源：安徽农业科学
