摘要：DNA甲基化是控制细胞基因表达的主要手段，也是迄今为止研究最广泛的表观遗传修饰形式。几乎所有人类癌症都表现出异常DNA甲基化，特别是在基因启动子区域的CpG岛，通常发生在癌症的早期阶段。然而，由于甲基化模式本身在整个基因组中渐进性和随机进化，导致细胞间甲基化高
DNA甲基化是控制细胞基因表达的主要手段，也是迄今为止研究最广泛的表观遗传修饰形式。几乎所有人类癌症都表现出异常DNA甲基化，特别是在基因启动子区域的CpG岛，通常发生在癌症的早期阶段。然而，由于甲基化模式本身在整个基因组中渐进性和随机进化，导致细胞间甲基化高度异质性，因此早期阶段DNA甲基化的评估可能会变得复杂。检测罕见和零星的肿瘤特异性异甲基化外显子需要开发具有高灵敏度、特异性和分辨率的方法，同时要足够简单和负担得起，以便整合到常规诊断和筛查实践中。
近日，杂志Science Advances上发表了一篇题为“Multiplex digital profiling of DNA methylation heterogeneity for sensitive and cost-effective cancer detection in low-volume liquid biopsies”的文章。作者提出了一种称为REM-DREAMing的方法，利用数字微流体与比率荧光检测方案和精确的dHRM分析，以单拷贝灵敏度对甲基化生物标志物面板的分子间表观遗传异质性进行并行分析。使用五重REM-DREAMing评估非小细胞肺癌（NSCLC）早期检测的五种生物标志物，优化的甲基化密度阈值大大提高了临床敏感性，在90%的特异性下达到93%，相应的AUC为0.96。
图片来源：Science Advances
主要内容
REM-DREAMing平台概述
REM-DREAMing平台的总体概述如下图所示。循环cfDNA首先通过磁珠从外周血液活检标本中提取，并进行亚硫酸盐转化（图A）。亚硫酸氢盐诱导未甲基化胞嘧啶变成尿嘧啶，改变了核酸碱基堆叠，降低了双链DNA （dsDNA）的热力学稳定性，导致扩增子熔融温度Tm发生可测量的变化。
为了能够同时评估多种甲基化生物标志物，REM-DREAMing引入了一种基于探针的比率荧光标记方法来进行dHRM测定。作者设计了简并碱基探针，可实现与目标位点的杂交，而不管甲基化模式如何。REM-DREAMing通过比率荧光团标记技术实现多路复用能力。每个探针对具有独特的红黄摩尔比，在特定位点创建独特的双色比率荧光特征（图B），每个PCR扩增的靶标都可以通过其不同的荧光特征比来识别（图C和D）。随后，基于EvaGreen的dHRM分析可以确定扩增DNA靶标的Tm，可直接推断出每个纳米孔中模板分子的甲基化密度（图D）。
REM-DREAMing平台概述。图片来源：Science Advances
REM-DREAMing验证
作者初步评估了该检测平台在临床相关应用中的性能。作者开发了一种基于DNA甲基化的五重 REM-DREAMing液体活检NSCLC筛查方法，包括CDO1, TAC1, HOXA7， HOXA9和SOX17。结果显示，根据观察到的荧光比值，可以很容易地区分每种生物标志物的荧光特征（下图B），并可基于EvaGreen的dHRM分析确定每个扩增子的甲基化密度（下图C）。
作者构建了一个标准曲线来验证五基因REM-DREAMing平台的分析性能。结果显示从0拷贝到150拷贝的线性拟合产生的斜率范围为0.80和0.85，线性拟合的R2值≥0.98。验证结果表明，通过结合比率荧光标记技术和dHRM分析，REM-DREAMing平台可以在单拷贝灵敏度下同时检测五种生物标志物的甲基化。
五重REM-DREAMing验证。图片来源：Science Advances
五重REM-DREAMing的临床验证
作者通过比较48份DNA样本中5个靶点的外显子分布，初步评估非小细胞肺癌五重REM-DREAMing检测的诊断潜力。甲基化密度分为以下几类：未甲基化（甲基化程度
单个生物标志物的诊断性能。图片来源：Science Advances
联用模型的NSCLC诊断性能
作者使用多元逻辑回归模型来评估生物标志物面板的组合性能，确定每个生物标志物的最佳甲基化密度阈值。总体而言，多变量模型的结果大大优于任何单个标记，临床敏感性为93%，临床特异性为90%，总体AUC为0.96（如下图）。
联用模型的NSCLC诊断性能。图片来源：Science Advances
总结与讨论
这篇文章中，作者提出了一种创新的低成本方法，称为REM-DREAMing，该方法利用数字微流体与比率荧光检测方案和精确的dHRM分析，以单拷贝灵敏度对甲基化生物标志物面板的分子间表观遗传异质性进行并行分析。使用五重REM-DREAMing评估非小细胞肺癌（NSCLC）早期检测的五种生物标志物，优化的甲基化密度阈值大大提高了临床敏感性，在90%的特异性下达到93%，相应的AUC为0.96。REM-DREAMing的另一个优点是所需样本量较少（1ml）。本研究的结果表明，五基因REM-DREAMing分析有可能通过大大减少不必要的侵入性和潜在危险的随访程序来改善CT扫描阳性患者的预后。
REM-DREAMing也有一些限制，需要改进以获得更好的临床适用性。目前的芯片每个模块的纳米孔数量有限，这限制了DNA测量的动态范围。此外，此研究受限于48个样本的队列规模，回顾性设计可能容易出现选择偏倚。后续研究需要在更大的前瞻性队列中进行验证，以减少过度拟合并更全面地评估临床表现。总的来说，REM-DREAMing为评估生物标志物面板的表观遗传异质性提供了一种解决方案，可用于许多诊断应用，有可能作为早期癌症检测的常规筛查工具。
来源：小桔灯网