CRISPR文库筛选主要应用场景介绍I

摘要：运用CRISPR/Cas9 高通量筛选技术在肿瘤细胞进行的阳性或阴性筛选，可以对靶向候选基因(编码和非编码基因)导向RNA(GRNA)进行富集，进而寻找感兴趣的目的基因。该技术的完整流程包含以下步骤:慢病毒文库构建，文库病毒感染细胞，细胞实验筛选，基因组DNA

运用CRISPR/Cas9 高通量筛选技术在肿瘤细胞进行的阳性或阴性筛选，可以对靶向候选基因(编码和非编码基因)导向RNA(GRNA)进行富集，进而寻找感兴趣的目的基因。该技术的完整流程包含以下步骤:慢病毒文库构建，文库病毒感染细胞，细胞实验筛选，基因组DNA提取与二代测序文库构建，二代测序与生物信息学分析。

CRISPR-SCREEN筛选详细流程

CRISPR文库是基于CRISPR/Cas9技术建立的高通量基因筛选方案。通过高通量合成sgRNA构建质粒文库，包装为慢病毒后以低MOI（通常＜0.3）感染待筛选细胞，确保一个细胞只进入一种sgRNA，再给细胞加以筛选因素（如药物处理、低氧处理、病毒感染或细胞本身的生存能力等），收集筛选后的细胞进行NGS测序，分析实验组与对照组之间sgRNA的富集或耗竭情况，获得与筛选因素相关的宿主因子。

生存所必需的基因筛选的应用

研究背景

肝细胞癌（HCC）是肝细胞转化引起的原发性肝癌，是全球第四大最常见和第二大致命癌症。

鉴于缺氧在 HCC 中的临床重要性，有必要了解支持缺氧中细胞适应的分子后果。到目前为止，比较常氧细胞和低氧细胞之间的转录组谱是鉴定缺氧相关基因的最常用方法。但是，这种方法也有缺点。

CRISPR -Cas9 敲除文库筛选是一种强大的正向遗传筛选方法，可用于识别负责其相关生物活性的基因。CRISPR-Cas9 已适用于全基因组筛选，具有混合g RNA 文库，以确定各种模型中癌细胞存活、转移和耐药性的分子机制。

研究结果

Highlights

人全基因组文库筛选应用于HCC 细胞系 MHCC97L ，并在常氧(20% O2)和缺氧 ( 1% O2)条件下处理细胞；

在缺氧下，携带靶向缺氧存活基因的 sgRNAs 的 HCC 细胞在gRNA cell pool处理中被负向选择并耗尽;

MAGeCK v0.5.7 算法分析：MAGeCK (Model-based Analysis of Genome-wide CRISPR-Cas9 Knockout): MAGeCK是一个用于分析CRISPR-Cas9基因敲除筛选数据的计算工具。它能够从大规模CRISPR筛选实验的测序数据中，鉴定出在细胞生存或增殖中起关键作用的基因。

低氧选择后，实现了大约 400× 的文库覆盖度，所有样品中保留了 95% 的 sgRNA 序列；

基因集富集分析（GSEA）显示, ，这些负向选择的基因在癌症标志物中显著富集，包括 Myc 靶点、OXPHOS、糖酵解和缺氧反应，突出表明这些基因在缺氧中赋予 HCC 细胞存活优势。

使用MAGeCK工具进行数据分析，通过计算RRA（Robust Rank Aggregation）得分，评估每个基因在筛选中的富集或稀缺情况。RRA得分越小，表示该基因在筛选中富集程度越高，重要性越大。根据RRA得分，对基因进行排序，筛选出在实验中具有显著富集或减少的基因。

筛选标准：通常设定筛选标准为Log2FC>log2(1.5)且P-value

结果分析：HIF-1α、HIF-1β、PTPMT1和HIF-2α分别是低氧生存文库筛选的第1、2、3和23个最重要的基因。常氧和缺氧突变细胞中sgrna的拷贝数是强相关的。HIF-1α、HIF-1β、PTPMT1和HIF-2α的sgrna在缺氧条件下降低。

缺氧突变细胞池中靶向HIF-1α、HIF-1β、PTPMT1和HIF-2α的sgrna的缺失。

结果分析：western blotting检测MHCC97L-Cas9-EV、-sgPTPMT1-1和-sgPTPMT1-2亚克隆的PTPMT1蛋白水平。放大后的合并图像显示PTPMT1定位于线粒体（比例尺，10 μm）。

（A）在 20% O 中培养的 MHCC97L-Cas9-EV、-sgPTPMT1-1 和 -sgPTPMT1-2 亚克隆的细胞增殖率2或 1% O24 天。

（B）将荧光素酶标记的 MHCC97L-Cas9-EV （n = 4）、-sgPTPMT1-1 （n = 4）和 -sgPTPMT1-2 （n = 4）亚克隆原位植入裸鼠肝脏的左叶。小鼠的 Xenogen 成像和原发性 HCC 肿瘤产生的生物发光的定量。

CRISPR文库在抗癌药物靶点发现中的应用

利用 CRISPR-Cas9 文库筛选方法进行抗癌药物发现的实验模型，包括体外模型、体内模型、类器官模型、组合学研究和小分子筛选。

研究背景

肝癌由于其侵袭性生长和较晚的症状出现，大多数HCC患者诊断为晚期，不适合手术治疗。索拉非尼（Sorafenib）是自2008年以来fda批准的用于晚期HCC的一线药物，然而，索拉非尼治疗HCC的临床疗效一般，仅能延长患者中位总生存期3个月。

耐药的发展被认为是导致索拉非尼治疗HCC患者失败的主要障碍。索拉非尼耐药的潜在机制是复杂的，在很大程度上仍然难以捉摸。进一步研究索拉非尼耐药的分子基础可能有助于发现新的靶点，合理地联合治疗以克服索拉非尼耐药。

肿瘤分子靶向药物面临的主要问题是耐药，因此探讨靶向药物的耐药机制有着重要的临床意义。经CRISPR文库正向筛选，绝大部分细胞因对药物敏感而死亡，部分细胞由于发生特定基因敲除产生抗药性而存活了下来。通过检测存活细胞携带的gRNA可以将与耐药性产生相关的基因筛选出来。

研究思路

CRISPR 文库筛选发现 PHGDH 是 Sorafenib 耐药的主要影响基因

A. 全基因组CRISPR/Cas9敲除文库筛选的工作流程

将含有65386个sgRNAs的人类全基因组CRISPR/Cas9敲除文库（GeCKO v2A）包装到慢病毒颗粒中，以低感染多重性（MOI）转染过表达Cas9的MHCC97L细胞（MHCC97L-Cas9）。用嘌呤霉素选择sgRNA转导的细胞产生突变细胞池。突变细胞在载体和索拉非尼中培养7天进行遗传筛选。从处理过的细胞中提取基因组DNA，用PCR扩增sgRNA片段。通过高通量测序确定sgrna的拷贝数，并使用MAGeCK v0.5.7算法进行分析

B. 在文库筛选中，PHGDH（磷酸甘油酸脱氢酶）被确定为最显著的基因（红点表示）

靶向PHGDH的sgrna在索拉非尼处理的细胞中持续减少。C. 火山图显示，靶向sgrna的PHGDH在索拉非尼治疗期间被负选择，这表明PHGDH是索拉非尼治疗后HCC细胞存活的必要基因。

Sorafenib耐药涉及丝氨酸合成途径的激活

MHCC97L细胞经索拉非尼处理112天后，在指定时间点对索拉非尼处理的MHCC97L细胞进行RNA-Seq分析

DAVID基因本体论和基因集富集分析（GSEA）显示，与亲本细胞（Day 0）相比，丝氨酸生物合成相关基因在索拉非尼耐药细胞（Day 112）中显著失调

RNA-Seq分析揭示，丝氨酸合成途径的关键酶PHGDH、PSAT1（磷酸丝氨酸氨基转移酶1）和PSPH（磷酸丝氨酸磷酸酶）在索拉非尼耐药细胞中均上调表达

Western blot也证实了PHGDH在蛋白水平上的上调表达。误差条表示上下限的平均值。原始数据作为数据源文件提供。

验证CRISPR/Cas9敲除文库筛选的结果

通过向MHCC97L-Cas9细胞中感染文库中包含的三个sgRNA以及另外的sgRNA，生成了稳定的PHGDH敲除（KO）子克隆。

PHGDH KO子克隆在体外对HCC细胞增殖有轻微的抑制作用，而PHGDH敲除有效地阻碍了细胞增殖（图3b），并在Sorafenib的存在下显著诱导细胞凋亡（图3c）。

为了用一种独立的方法巩固我们的CRISPR/Cas9敲除文库筛选结果，我们在MHCC97L中使用两个独立的shRNA序列生成了PHGDH敲低子克隆（图3d）。

同样地，shRNA介导的PHGDH敲低重现了sgRNA介导的KO在HCC细胞中对Sorafenib治疗的敏感性（图3e）。 PHGDH敲低在Sorafenib的存在下也显著诱导了细胞凋亡（图3f）。

试图用体内模型来验证这一观察结果。我们分别将PHGDH敲低（shPHGDH）和非靶向对照（NTC）MHCC97L细胞接种到裸鼠左右侧腋窝中。当肿瘤在第21天可触及时，将裸鼠分别给予索拉非尼（Sora）或车辆对照（Vehicle）治疗21天。更为显著的是，虽然来自NTC细胞的肿瘤持续生长，但索拉非尼治疗完全抑制了PHGDH细胞在小鼠中的肿瘤生长（图3g）。上述发现表明，PHGDH失活可增强HCC细胞对索拉非尼治疗的敏感性。海星生物一站式CRISPR文库筛选方案，包括sgRNA文库定制、文库质粒构建、文库质粒慢病毒包装、CRISPR文库筛选、高通量测序与生信分析。还有大量现货人和小鼠的全基因组敲除文库。