PBJ | PTST2b 和 MRC 基因调控马铃薯块茎中淀粉颗粒形态发生的分子机制解析

摘要：马铃薯植物富含淀粉的块茎是世界许多地方膳食碳水化合物的主要来源。淀粉是植物中主要的储存碳水化合物，在碳水化合物聚合物中是独一无二的，因为它会形成半结晶、不溶性颗粒。马铃薯块茎的淀粉颗粒在主要作物中是独一无二的，因为它们非常大（它们的平均直径是玉米淀粉颗粒的两倍

马铃薯植物富含淀粉的块茎是世界许多地方膳食碳水化合物的主要来源。淀粉是植物中主要的储存碳水化合物，在碳水化合物聚合物中是独一无二的，因为它会形成半结晶、不溶性颗粒。马铃薯块茎的淀粉颗粒在主要作物中是独一无二的，因为它们非常大（它们的平均直径是玉米淀粉颗粒的两倍多）并且具有明显的椭球形状。椭球状颗粒形态可能是由淀粉体施加的物理限制或颗粒生长过程中由特定蛋白质介导的聚合物的受控沉积引起的。

近日，Anton Hochmuth 在国际知名期刊《Plant Biotechnology JouRNAl》上在线发表题为“Distinct effects of PTST2b and MRC on starch granule morphogenesis in potato tubers”的研究论文，该研究发现 PTST2b 是马铃薯块茎中的主要 PTST2 亚型，不会影响颗粒大小或起始的颗粒数量，但在控制颗粒形状中起着重要作用。马铃薯块茎中未检测到MRC表达，但当在块茎中异位过表达时，它会导致形成形状不规则的淀粉颗粒——其中许多来自多个起始点。该研究对起始蛋白的不同作用、马铃薯颗粒形状的控制及其对淀粉理化性质的影响提供了新的见解。

首先，该研究使用系统发育树分析来识别拟南芥颗粒起始蛋白的马铃薯直系同源物，并检索了 Phytozome、SolGenomics 和 SpudDB 数据库，以查找来自其他茄科物种以及 Viridiplantae 的不同物种的同源物。有趣的是，马铃薯和其他一些茄科物种（Nicotiana benthamiana 和 Capsicum annum）有两个 PTST2 旁系同源物，并将其命名为 PTST2a 和 PTST2b，PTST2a 和 PTST2b 存在于其他茄科物种中，并且位于马铃薯的不同染色体上，这一事实强烈表明它们是茄科分化期间早期重复产生的旁系同源物，而不是四倍体马铃薯中单个 PTST2 基因座的等位基因变异。然而，Solanum melongena 和 Solanum lycopersicum 基因组仅包含 PTST2a，表明它们丢失了 PTST2b。随后，作者使用 RT-qPCR 评估商业品种 Clearwater Russet 的叶子和块茎中起始蛋白的转录水平。在叶片和块茎中均检测到大多数基因的转录本，证明了马铃薯块茎中表达了一种独特的颗粒起始蛋白，其中包括PTST2b，且都缺乏MRC。

图1.PTST2a 和 PTST2b 是茄科基因复制的结果，在马铃薯块茎中表达

为了进一步研究 PTST2a 和 PTST2b 的不同之处，作者首先比较了它们的氨基酸序列。马铃薯 PTST2a 和 PTST2b 的完整氨基酸序列在 BLASTp 比对下具有 58% 的同一性和 70% 的相似性，它们在 DNA 水平上的编码序列在 ClustalW 比对后显示出 74% 的同一性。两个旁系同源物在 C 端都有典型的 CBM48 结构域，共享 80% 的同一性和 90% 的相似性。有趣的是，用于预测亚细胞定位的 TargetP 程序，只能预测 PTST2b 的质体转运肽。尽管如此，作者通过在本氏奈瑟菌中瞬时表达融合版本到 C 端 YFP 标签，实验证实了两种 PTST2 旁系同源物都是质体的。卷曲线圈通常与蛋白质-蛋白质相互作用有关。鉴于 PTST2a 和 PTST2b 之间卷曲螺旋区域的可变性，作者使用成对免疫沉淀比较了这些亚型与其伴侣蛋白相互作用的能力与在 Nicotiana 叶中异源表达的蛋白质。与拟南芥 PTST2 一样，PTST2 旁系同源物都可以与 MFP1 和 MRC 相互作用；与小麦的 PTST2 直系同源物不同，PTST2a 和 PTST2b 在该测定中都不能与 PHO1a 相互作用。最引人注目的是，在这些测定条件下，作者无法检测到 PTST2b 和 SS4 之间的相互作用，而检测到 PTST2a 和 SS4 的强相互作用。结合伴侣特异性和系统发育发生的限制性的这种差异表明 PTST2b 在特征 PTST2 蛋白中是独一无二的，值得进一步研究。

图2.PTST2a 和 PTST2b 在蛋白质-蛋白质相互作用伙伴方面有所不同

通过上面的分析揭示了马铃薯块茎中颗粒起始蛋白补体的两个独特特征：1）存在独特的 PTST2b 旁系同源物和 2） MRC 不存在或表达非常低。为了研究这些特征对淀粉颗粒数量和形态的意义，作者通过在 35S 启动子下表达 PTST2b 序列的反向重复，使用 RNA 干扰（siPTST2b 系）创建了 PTST2b 的组成型沉默系;以及组成型 MRC 过表达系（MRC-OE 系），以在块茎发育过程中使用 35S 启动子诱导 MRC 表达。所有线路均在 Clearwater Russet 中生成。使用空向量（CW Empty）转换的线被隔离为对照。在温室中培养来自 siPTST2b 和 MRC-OE 初始转化体的块茎（每个系 12 个独立系），并使用流式细胞仪同时筛选颗粒大小和或形状的变化。结果表明，PTST2b 沉默可能会影响颗粒形状， MRC 过表达会影响颗粒大小，但无法得出颗粒形状的结论。

图3.PTST2-RNAi 和 MRC-OE 转基因品系中的淀粉颗粒粒度分布

因此，为了详细探索转基因品系中的淀粉颗粒形态，作者通过扫描电子显微镜（SEM）分析了纯化的淀粉颗粒。引人注目的是，四个选定的 siPTST2b 品系中的颗粒看起来几乎是完美的球形，而不是在空载体对照中观察到的典型卵形形态。MRC-OE 系列中的颗粒不仅更小，而且形状看起来更不规则。

图4.siPTST2b 和 MRC-OE 转基因系的淀粉颗粒形态

为了量化转基因品系中颗粒形态的这些变化，作者开发了一种基于成像流式细胞仪的新型方法来分析样品中淀粉颗粒形状的多样性。每个样品采集了 20 000 张颗粒图像，在过滤以去除包含多个颗粒和非淀粉颗粒的图像后，单个颗粒的 75%-82% 的图像质量足以量化形状参数并计算了两个形状参数——圆度和纵横比。结果表明，无论颗粒大小如何，siPTST2b 品系都能产生球形颗粒，而在对照和 MRC-OE 品系中，只有较小的颗粒是球形的。

图5.来自成像流式细胞术的颗粒形状参数

PTST2 和 MRC 对颗粒形状的这种影响是意料之中的，因为在拟南芥中，这些蛋白质影响淀粉颗粒起始的数量和颗粒大小，但不影响颗粒形状。最后，为了评估淀粉颗粒数量，作者使用光学显微镜检查了块茎薄壁组织薄片中的颗粒。在这些切片中可以看到 siPTST2b 和 MRC-OE 品系中淀粉颗粒形状的明显变化。然而，在 siPTST2b 系中，每个细胞的颗粒数没有显著改变。

图6.沉默 PTST2b 不会改变每个细胞的颗粒数。

总体而言，通过数据表明，PTST2b 不是正确淀粉颗粒数量所必需的，而是马铃薯块茎中正确颗粒形态所必需的。siPTST2b 生产线由于各向异性颗粒生长的损失而产生球形颗粒。相比之下，MRC 的过表达似乎增加了不规则颗粒的频率，其中许多颗粒是由多次起始引起的。为了确保我们的转基因品系中颗粒形态的变化与沉默或过表达的程度相关，作者使用 RT-qPCR 评估了更广泛的转基因品系中 PTST2b 和 MRC 转录物积累的量，并将这些值与迄今为止观察到的主要表型的定量测量相关联。在 PTST2b 品系中，将基因表达水平与通过成像 FC 测量的颗粒的平均纵横比相关联，这表明球形颗粒表型与 PTST2b 沉默的程度高度相关。

图7.颗粒形态表型与 PTST2b 沉默或 MRC 过表达的程度相关

鉴于转基因品系中淀粉颗粒形状和大小分布的这些改变，作者研究了它们是否伴随着块茎大小或块茎组成的差异。对于 siPTST2b 品系，温室中产生的块茎总数与对照品系相同。siPTST2b 品系的每株植物总块茎重量显著高于野生型，但这不太可能是沉默 PTST2b 的直接结果，因为它在所有单个品系中均未见。此外，野生型和 siPTST2b 之间单个块茎的平均重量没有差异。siPTST2b 品系的水分含量和淀粉含量也没有改变。MRC-OE 植物每株生产相似数量的块茎，但与 siPTST2b 品系相比，块茎重量约为对照的一半，导致每株植物的块茎产量（按重量计）显著降低。虽然 MRC-OE 块茎具有相同的水分含量，但淀粉含量显著低于对照。因此，淀粉含量的降低很可能使得其观察到的颗粒较小。