【论著】2型及非2型支气管哮喘患者呼吸道共生微生物网络的作用特征

摘要：引用本文:王雯, 王斐然, 郭越, 等. 2型及非2型支气管哮喘患者呼吸道共生微生物网络的作用特征[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2024, 47(12): 1121-1129. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20241015-006

引用本文:王雯, 王斐然, 郭越, 等. 2型及非2型支气管哮喘患者呼吸道共生微生物网络的作用特征[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2024, 47(12): 1121-1129. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20241015-00611.

摘要

目的研究2型及非2型支气管哮喘（简称哮喘）患者呼吸道共生微生物网络的作用特征。

方法基于哮喘患者队列的前瞻性研究。采集2021年5月至2022年5月，首都医科大学附属北京朝阳医院呼吸与危重症学科收治的55例哮喘患者［男25例，女30例，中位年龄47.7岁（年龄范围34.3~63.0岁）］及来自首都医科大学附属北京朝阳医院体检中心的12名健康对照者的呼吸道诱导痰样本；根据呼出气一氧化氮（FeNO）水平，将哮喘患者分为高FeNO组22例（FeNO≥40 ppb，即2型哮喘组）、低FeNO组33例（FeNO

结果健康对照组微生物群落中，厚壁菌门和变形菌门的占比（分别为29%和21%）均少于哮喘组患者（低FeNO组分别占37%和33%，高FeNO组分别占42%和26%）。低FeNO组的微生物网络有64对边，形成了16个群落；约75%的节点特征向量中心度的数值在0~0.05，25%的节点的特征向量中心度的数值在0.10~0.45；κ-核分解有4层，大约42%的顶点在中心的2层。高FeNO组的微生物网络有80对边，形成了18个群落；81% 的节点特征向量中心度的数值在0~0.05，19% 的节点的特征向量中心度的数值在0.10~0.35；κ-核分解有8层，21%的顶点位于中心的2层。低FeNO组和高FeNO组的主要功能差异表现在代谢途径（包括糖类、脂类、氨基酸和能量代谢）、抗药性、生物膜传输、信号传导、胞间通讯、细胞修复中。

结论与非2型哮喘患者相比，2型哮喘患者的呼吸道微生物菌群的α-多样性更高，变形菌门的微生物含量更低，微生物网络更为聚集；两种内型哮喘患者的代谢功能预测结果有显著差异。

支气管哮喘（简称哮喘）是一种慢性气道疾病。根据是否存在2型炎症，哮喘可分为2型哮喘和非2型哮喘，2型哮喘以高呼出气一氧化氮（FeNO）、高嗜酸性粒细胞计数为特征［ 1 , 2 ］。这两种内型对糖皮质激素的治疗反应差别非常明显，其呼吸道微生态的特征可能是原因之一［ 3 ］。随着宏基因组二代测序以及生物信息学的发展，两种类型患者呼吸道的不同微生态特征及其与炎症类型的关联得以被揭示［ 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 ］。比如2型哮喘患者的呼吸道菌群中含有更高比例的放线菌门，且其含量与嗜酸性粒细胞计数明显正相关［ 11 , 12 ］除了菌群组成不同，呼吸道菌群之间彼此的相互作用也和哮喘的症状和炎症类型有关，其微生物共生网络的特征对于代谢和病理过程非常重要［ 13 , 14 , 15 ］。本研究的目的是探讨2型和非2型哮喘患者呼吸道共生微生物网络的特征差异。

对象与方法

一、研究对象

基于哮喘患者队列的前瞻性研究。本研究纳入2021年5月至2022年5月，首都医科大学附属北京朝阳医院呼吸与危重症学科收治的55例哮喘患者及北京朝阳医院体检中心体检的12名健康对照者，收集其呼吸道诱导痰样本。

哮喘患者纳入标准：（1）符合2024版《全球哮喘管理和预防策略》［ 16 ］中哮喘的诊断标准；（2）患者本人完全理解并同意本临床医疗研究的目的和实施，能配合医师完成诱导痰的采集。排除标准：（1）接受免疫抑制剂或长期类固醇激素治疗的恶性肿瘤、慢性自身免疫性疾病患者；（2）心肝脑肾等重要脏器严重受损者；（3）严重精神疾病患者；（4）妊娠或哺乳期患者。本研究已经过首都医科大学附属北京朝阳医院伦理委员审查会批准［（2020）425 号］，参与本研究的哮喘患者及健康对照者均签署知情同意书。根据FeNO水平，再将纳入的55例哮喘患者再分为高FeNO组22例（FeNO≥40 ppb［ 17 , 18 ］，即2型哮喘组）和低FeNO组33例（FeNO

二、诱导痰采集和肺功能的测定

诱导痰采集步骤按照指南相关内容进行［ 19 , 20 ］。首先在雾化前10 min让患者吸入沙丁胺醇200~400 μg，以防止患者出现哮喘急性发作；嘱患者用清水漱口、擤鼻，以3%氯化钠注射液对患者雾化10~15 min后，嘱患者用清水漱口，将唾液尽量吐净，用力咳出深部的痰液到无菌容器中。如果此过程患者没有痰液咳出，则再次以4%氯化钠注射液雾化吸入5~10 min，再次嘱患者用力咳出深部的痰液到无菌容器中。痰液咳出后及时送检。肺功能根据《中国国家肺功能测定指南》［ 21 ］，采用耶格Masterscreen PFT System肺功能仪进行测定。肺功能的测定时间为完成诱导痰操作前。

三、DNA 抽提和PCR扩增

根据E.Z.N.A.soil试剂盒（美国Omega Bio-tek公司）说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；用338F（5′ ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3′）和806R（5′ GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3′）引物对V3~V4可变区进行PCR扩增，扩增程序为：95 ℃ 预变性3 min，27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min（PCR仪：ABI GeneAmp®9700型）。扩增体系为20 μl，4 μl 5×tiFastPfu 缓冲液，2 μl 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μl 引物（5 μmol/L），0.4 μl FastPfu 聚合酶；10 ng DNA模板。

Illumina MiSeq测序：使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美国Axygen Biosciences公司）进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluor™-ST（美国Promega公司）进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台（美国Illumina公司）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库。

构建文库步骤：（1）连接“Y”字形接头；（2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；（3）利用PCR扩增进行文库模板的富集；（4）氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

利用Illumina公司的Miseq PE 300平台进行测序采用SPSS 25.0软件，计量资料以 P值设为 0.05。用R语言［ 24 , 25 ］运行微生物组多变量关联线性模型（MaAsLins），以检验微生物组与临床变量之间的关联，包括以下R包：taxa［ 26 ］、ggplot2、mix Omics［ 27 ］、Tax4Fun2［ 27 , 28 ］、network［ 29 ］。R的模块Igraph（version 1.2.5）［ 30 ］用于微生物网络分析。此外，还利用PCRUST平台预测了京都基因和基因组百科全书（KEGG）中微生物群落的功能谱［ 31 ］。

1. 菌群共存网络的构建：首先，运用R语言里的corr.test函数分组计算了单个组别中所有菌种之间的Spearman相关性系数，得到相关性系数矩阵和 P值矩阵；并且采用Benjamini和Hochberg false discovery rate（FDR）方法矫正上述步骤中所得到的P值。其次，基于Spearman相关性矩阵和校正后的P值矩阵建立两组呼吸道菌群共存网络。Spearman相关系数和校正后的P值的阈值分别为0.6和0.001。网络中的每一个节点（Node）代表一个菌种，连接节点之间每一个边（Edge）代表各菌种之间的相关性。菌群共存网络的构建是应用R语言中的graph_from_adjacency_ matrix函数。

2. 网络拓扑结构的基础分析：为了更好地了解所构建网络的拓扑结构，我们采用R语言中的igraph包中的相关函数计算并获得一系列基础的网络参数，其中包括边数（number of edges）、节点数（number of nodes）、连接性（connectance）、平均度（average degree）、平均介数（average betweenness）、平均路径长度（average path length）、平均最近邻度（average nearest-neighbor degree）、直径（diameter）、聚集系数（clustering coefficient）、介数中心性（betweenness centralization）、度中心性（degree centralization）、模块性（modularity）、模块数（number of modules）。此外，对网络中单个节点的度和介数中心性进行计算。应用网络k核分解方法计算并展示了两组菌群共存网络结构。

结果

一、受试哮喘患者特征描述

表1 列出了受试哮喘患者（高、低FeNO组）的临床指标。高FeNO组大多数小气道指数［用力呼出25%、50%、75%肺活量的呼气流速（MEF255075）及MEF25/MEF75］的数值均低于低FeNO组（均PP<0.01）。高FeNO组和低FeNO的中性粒细胞计数、体重指数、ACT评分等方面差异无统计学意义。

二、菌群组成

不同组受试人群的诱导痰菌群组成如图1 所示。与健康对照组相比，两组哮喘患者微生物群落中中观察到变形菌门的细菌丰度均更多。在门的水平，低FeNO组和高FeNO组的差异主要在厚壁菌门和变形菌门，包含了普雷沃菌属、韦荣球菌属、链球菌属、奈瑟菌属和嗜血杆菌属。在低FeNO 组，厚壁菌门和变形菌门分别占37%和33%；在高FeNO组，厚壁菌门和变形菌门则分别占42%和26%。而健康对照组厚壁菌门和变形菌门的占比均少于哮喘组患者（分别为29%和21%）。