【东东工艺指南】胶原蛋白纯化（下）

摘要：关于胶原蛋白，上期我们与您探讨了其纯化工艺并介绍了我们的解决方案，整体上介绍了切向流过滤和层析在胶原蛋白纯化中的应用，本期我们将进一步进行不同表达体系下胶原蛋白纯化工艺相关探讨。

转自：东富龙

关于胶原蛋白，上期我们与您探讨了其纯化工艺并介绍了我们的解决方案，整体上介绍了切向流过滤和层析在胶原蛋白纯化中的应用，本期我们将进一步进行不同表达体系下胶原蛋白纯化工艺相关探讨。

引言

胶原蛋白的三种制备方法中，除了化学合成法由于技术复杂、成本较高、无生物活性，仅限于实验室研究，动物源提取法和基因重组法都在商业规模得到广泛应用。动物提取胶原蛋白经济高效，广泛应用于食品和制药行业，但可能具有引起免疫源性反应的风险；而重组胶原蛋白通过模拟天然胶原蛋白中的翻译后修饰，如羟基化与糖基化，从而实现与人类胶原蛋白高度相似性，兼具安全性高，无免疫排异，批次稳定，生产规模可放大的优势[1]，占据胶原蛋白市场主导地位。

重组胶原蛋白纯化工艺

为了生产重组胶原蛋白，表达系统的确立至关重要。目前已经探索了包括哺乳动物、昆虫、酵母、细菌细胞在内的多种表达系统，像CHO和HEK293等哺乳动物细胞的翻译机制与人类细胞最为相似，但是产量较低而成本较高阻碍了工业规模生产，而细菌与酵母表达系统更具成本效益，操作性强，适宜工业化生产[1]。

在重组胶原蛋白的表达过程中，存在酶促反应控制等问题，要实现高纯度、低抗原性与高表达量等指标的平衡颇具难度。正因如此，其大规模量产以及商业化推进的进程较为缓慢。目前国内能够大规模批量生产的企业主要为创健医疗、锦波生物、巨子生物和江山聚源等，均因在关键技术上获得核心突破。行业内部分已实现产业化的重组胶原蛋白竞争格局如下：

表1.重组胶原蛋白市场竞争格局

*资料来源：乐晴智库国家知识产权局公开整理

由此可见市面上的重组胶原蛋白主要是通过大肠杆菌和酵母表达，对于这两种不同表达系统的重组胶原蛋白，东富龙生物工艺耗材团队都能为您提供其下游纯化工艺解决方案，并且在重组胶原蛋白的分离纯化领域具有丰富的经验。

重组胶原蛋白纯化工艺方案

—大肠杆菌胞内表达

大肠杆菌表达系统的主要杂质是细胞代谢产物，比如宿主蛋白，内毒素等。对于胞内可溶表达的目标产物，首先要将菌体破碎，澄清过滤等前处理，再选用合适的层析方法提高目标产物纯度，离子交换层析应用较多，如目标物带有纯化标签可考虑先加一步亲和层析，我们推荐的工艺步骤如下图所示。

图1. 大肠杆菌表达胶原蛋白纯化工艺方案

澄清

大肠杆菌破碎离心后仍有较多杂质，在上层析之前料液浊度需降低到至少20NTU以下。

图2. TanFlux® II PES 0.45μm澄清的过滤表现

该案例中使用TanFlux® II PES 0.45μm膜包澄清之后，料液浊度从82.4NTU降至1.05NTU，载量达到190L/m²，为后续纯化的顺利进行打好了基础。

层析

对于带His标签蛋白的重组蛋白，可首先考虑Ni离子亲和层析介质，配合离子交换层析实现纯化目的。

图4. 层析结果：终产品HPLC纯度图（左）；

终产品SDS-PAGE纯度图（右）

此案例为大肠杆菌表达的I型胶原蛋白，由于蛋白带有His标签,层析步骤最终采用Ni Purose 6FF亲和层析加 SP Purose 6FF两步层析法。东富龙提供不同类型的Ni离子亲和层析介质，本案例所用的Ni-Purose 6FF具有高载量，高回收率等特点，配合阳离子交换层析介质SP Purose 6FF, 最终得到纯度95%，收率85%的目标产物，满足实际生产要求。

表2.大肠杆菌表达胶原蛋白纯化案例相关填料产品信息

对于若不带有纯化标签的胶原蛋白，也可选择合适的离子交换层析介质或者多模式层析介质等，在工艺优化中充分考虑多种层析类型进行搭配组合，逐渐优化以达到理想的目标。

重组胶原蛋白纯化工艺方案

—毕赤酵母分泌表达

毕赤酵母是一种真核细胞表达系统，其特点为表达量较高，并且由于其为分泌表达，所以不需要有细胞破碎的过程，发酵液收获后可通过过滤或离心去除大部分杂质，使用超滤膜包进行料液的浓缩换液，层析纯化选择疏水层析为多，可再加一步混合模式层析精纯，如下图工艺路线所示：

图5. 毕赤酵母表达胶原蛋白纯化工艺方案

层析

该案例为毕赤酵母表达系统表达的胶原蛋白，经过工艺优化，最终确定的色谱层析工艺为Phenyl Purose 6FF(HS)疏水层析捕获结合Rigose MMC Hires阳离子复合模式两步法。结果下图所示，最终得到纯度96%，收率90%的目标产物，满足实际生产要求。

SDS-PAGE纯度图（右）

SDS-PAGE纯度图（中），HPLC纯度图（右）

表3. 毕赤酵母表达胶原蛋白纯化案例相关填料产品信息

由于不同的胶原蛋白的理化性质不同，纯化要求也不同，层析工艺可根据具体情况选择，疏水层析，离子交换层析和混合模式层析都在可选范围内，其中疏水层析应用较多，其他案例中也可通过一步Phenyl Purose 6FF疏水层析得到纯度>90%，收率>70%的目标产物，适用于化妆品，原料制备，二类医疗器械生产项目。

浓缩换液

层析纯化后的料液需通过超滤进行浓缩换液，提高样品浓度以及换液脱盐。

图8. TanFlux® II PES 10KD浓缩换液过滤表现

该案例中使用TanFlux® II PES 10KD浓缩换液，浓缩4倍后透析5倍除去一些小分子色素，平均通量约110LMH，收率高达98.9%。

动物源提取胶原蛋白纯化工艺

动物源胶原蛋白是以动物组织（猪、牛、鱼）通过前处理，酸法、碱法、酶法溶出，纯化制备的具有天然胶原完整蛋白片段和三螺旋结构的胶原蛋白，在结构上保证胶原蛋白的生物学活性。一般生产工艺如下图所示：

图9. 动物源提取胶原蛋白纯化工艺方案

浓缩换液

盐析后的料液需通过超滤进行浓缩换液，提高样品浓度以及换液脱盐。

图10. TanFlux® II RC 100KD浓缩换液的过滤表现

该案例中使用TanFlux® II RC 100KD浓缩换液，浓缩4倍后透析3倍除去一些小分子蛋白，平均通量约19LMH，收率达89%。

层析

其中，层析纯化过程为动物源胶原蛋白纯化的关键步骤，如下案例中，经东富龙弱阳离子交换介质CM Purose 6FF层析后的结果如下图所示，除杂效果明显，处理量较为可观，为工业化制备动物源胶原提供了较优的解决方案。

图11.CM Purose 6FF层析图谱（左），SDS-PAGE纯度图（右）

表4. 动物源提取胶原蛋白纯化案例相关填料产品信息

结语

在本期推送中，我们通过实际案例的分享，深入探讨了胶原蛋白纯化工艺的多样性，每种不同的胶原蛋白之间存在差异性，最适用的工艺耗材产品与工艺方法参数也都有所不同，这需要研发者根据具体情况进行不断的优化和筛选，东富龙生命科学下游纯化工艺团队凭借专业的技术背景，以及对胶原蛋白纯化的丰富经验，致力于为您在工艺开发过程中解决各种疑难杂症，为您的产品开发提供助力！