摘要：自然杀伤细胞（nature killer，NK）是除T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，可自发识别体内异常细胞，并通过细胞毒性作用将其迅速清除，同时产生各类促炎因子和趋化因子，招募和激活其他免疫细胞以启动适应性免疫反应。
转自：优宁维抗体专家
自然杀伤细胞（nature killer，NK）是除T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，可自发识别体内异常细胞，并通过细胞毒性作用将其迅速清除，同时产生各类促炎因子和趋化因子，招募和激活其他免疫细胞以启动适应性免疫反应。
接下来小优会从NK细胞来源-体外扩增培养-鉴定-热门研究四个方面带大家通关不同来源的NK细胞培养！之前小优也给大家介绍了《免疫卫士-T细胞培养攻略》，《DC细胞培养攻略》，《B细胞培养攻略》，小伙伴们按需查看呦~
NK细胞来源
NK细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结，约占外周淋巴细胞的5-20%。在血液、骨髓、脾脏和肺部，NK细胞主要是成熟（CD56dimCD16+）和终末分化（CD56dimCD16+CD57+）的亚群，具有较高的效应功能。在淋巴结、扁桃体和肠道中，NK细胞的频率较低，主要由不成熟（CD56brightCD16−）亚群组成，这些亚群的效应能力较低[1]。
所以体外培养的NK细胞来源可以是实体组织（骨髓、脾脏、肝脏、淋巴结等）、血液、直接购买商品化的原代NK细胞或NK细胞系（NK-92等）。具体样本制备和细胞分选的内容，小伙伴们可以参考之前的文章：《免疫细胞培养通关技巧之样本制备》和《免疫细胞培养通关技巧之细胞分选》。
图1 NK细胞发育、分布[2]
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小鼠脾脏组织解离试剂盒，高效制备单细胞悬液
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NK细胞体外扩增培养
NK细胞体外也面临着很多挑战：NK细胞在外周血中占比很低，PBMC起始扩增NK比例低；NK细胞不易扩增且容易耗竭，培养需要加入血清或饲养层细胞；NK细胞扩增之后很难维持其细胞毒性作用，因此我们可以使用不同的NK细胞培养因子组合方案以应对上述挑战：IL-2&IL-12&IL-15可促进NK细胞分化扩增；IL-12&IL-18可增强NK细胞抗原敏感性；IL-21可增强NK细胞的细胞毒性作用。
接下来，小优用四个案例给大家详细介绍：
01
外周血来源的NK细胞（PB-Derived NK Cells）
① 调整人全血中分选的NK细胞密度为1*106 cells/mL，重悬至含有5%血清的X-VIVO 15培养基中；
② 加入200 U/mL IL-2，10 ng/mL IL-15和1*106 cells/mL的K562细胞（丝裂霉素处理灭活）。在15天的扩增过程中，每隔2-3天对NK细胞进行一次传代，补充细胞因子和新鲜制备的K562细胞[3]。
02
脐带血来源的NK细胞（UCB-Derived NK Cells）
①分选CD34+细胞：从脐带血中使用CD34阳性选择磁珠分离表达CD34的造血干细胞/祖细胞；
②将分选出的CD34+细胞以造血干细胞分化培养基（DMEM/F12+ 20%热灭活人AB型血清+ 5 ng/mL亚硒酸钠、50 µM乙醇胺、20 mg/mL抗坏血酸+ 2 mM L-谷氨酰胺、1%双抗、25 µM β-巯基乙醇）重悬，接种在经过照射处理的OP9-DLL4细胞上，并保持添加下列细胞因子，5 ng/mL IL-3（仅第一周添加），20 ng/mL SCF，10 ng/mL IL-15，10 ng/mL FLT3L，20 ng/mL IL-7；
③每周更换一次培养基以提供持续的营养和生长因子支持，28至35天左右可通过流式细胞术检测细胞表面标志物的变化，当细胞发展成为CD45+CD56+CD33−CD3−表型时，说明已经发育成为NK细胞[4]。
03
hPSC来源的NK细胞[5]
1）造血祖细胞分化
①使用OP9骨髓基质细胞作为支持细胞，与H1细胞（α-MEM+20%FBS）共同培养来诱导造血祖细胞分化；
②共同培养大约12天后，在培养物中可以观察到许多分化的菌落，并且能够检测到小部分CD34+细胞的存在。
2）诱导NK细胞分化
①收获经过“造血祖细胞分化”阶段后获得的细胞，并将其与表达Notch配体Delta-like-1（DLL1）的OP9细胞变体（OP9-DLL1细胞）共培养；
②在含有20% FBS、10 ng/mL SCF、5 ng/mL FLT3L、5 ng/mL IL-7、10 ng/mL IL-15的α-MEM培养基中，每周进行一次这样的共培养。
③第一周期共培养结束后（第19天），大部分细胞仍然保持贴壁生长状态。
④第二周期（第26天），开始出现一些明亮、圆形、半悬浮的细胞。
⑤第三周期（第33天），这些细胞逐渐脱离并聚集在培养孔中心。
⑥第四周期（第40天），更多的悬浮细胞显现出来，形态上表现为小型、圆形、明亮的淋巴细胞；可通过流式细胞术鉴定，细胞表型为CD45+CD56+CD3−TCRαβ−CD4−CD8−，即NK细胞。
hPSC诱导NK细胞过程中形态监测[5]
04
NK细胞系：NK-92
NK-92细胞系的培养相较于原代NK细胞来说要简单很多，调整NK细胞密度为2.5×105/mL，重悬至完全培养基（RPMI 1640+5%FBS+2 mM L-glutamine+10 U/mL双抗+20 U/ml IL-2）[6]，每2-3天更换新鲜的完全培养基。
小优也汇总了上述各种来源的NK细胞体外扩增培养方案，可供参考~
NK细胞鉴定
NK细胞亚型鉴定最常用的方法是流式，关于流式鉴定的基本内容大家可以参考《免疫细胞培养通关技巧之分型鉴定》。Human常用NK鉴定指标为：CD3-CD56+CD16+/-。人NK细胞常分为CD56++CD16+/-和CD56dimCD16++两个亚群，外周血或其他非纯化NK细胞的样本，检测时还要加上CD3同时检测，以排除一类特殊T细胞—NKT（CD3+CD56+）。Mouse常用NK鉴定指标为CD3e-CD49b+NK1.1+NKP46+，但NK1.1和CD49b选择要根据小鼠的品系：NK1.1：表达在C57BL，FVB/N, NZB，但在AKR，BALB/c，CBA/J，C3H，C57BR，C58，DBA/1，DBA/2，NOD，SJL，129中不表达。CD49b：由于还会表达在胸腺上皮细胞、B细胞、单核细胞等中，在用于NK鉴定时，更推荐抗原克隆位点为DX5的抗体，特异性会更强，基本所有小鼠品系都表达，但在NOD中不表达。更多详细内容可以查看《人和小鼠的NK细胞研究指标怎么选？》。
人NK细胞分型、比例、标记物、分布及功能（源自美天旎）
小鼠NK细胞分型、比例、标记物、分布及功能（源自美天旎）
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CD3 Antibody, anti-human, APC, REAfinity™ 130-113-135
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NK细胞热门研究
NK细胞的热门研究也非常多，比如肿瘤微环境中NK细胞亚型和功能、NK细胞耗竭、肿瘤免疫逃逸、NK细胞与其他细胞之间的相互作用、CAR-NK、NK细胞功能研究等等。例如24年的一篇文章将NK细胞、T细胞、肿瘤细胞一起共培养，加入三联抗体后，通过共聚焦显微镜成像和ELISA检测共培养上清中细胞因子的含量，以观察三联抗体是否可以增强NK细胞和T细胞与肿瘤细胞的相互作用，并且刺激两者细胞毒性颗粒的释放（图1）[7]。
NK细胞、T细胞、肿瘤细胞共培养[7]
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关于NK细胞的培养就到这里啦，更多细胞培养攻略敬请期待~
参考文献：
1. Dogra, P., et al., Tissue Determinants of Human NK Cell Development, Function, and Residence. Cell, 2020. 180(4): p. 749-763.e13.
2. Crinier, A., et al., SnapShot: Natural Killer Cells. Cell, 2020. 180(6): p. 1280-1280.e1.
3. Li, F., et al., CCL5-armed oncolytic virus augments CCR5-engineered NK cell infiltration and antitumor efficiency. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2020. 8(1).
4. Goldenson, B.H., et al., Umbilical Cord Blood and iPSC-Derived Natural Killer Cells Demonstrate Key Differences in Cytotoxic Activity and KIR Profiles. Frontiers in Immunology, 2020. 11.
5. Zeng, J., et al., Generation of “Off-the-Shelf” Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports, 2017. 9(6): p. 1796-1812.
6. TÖRnroos, H., H. HÄGerstrand, and C. Lindqvist, Culturing the Human Natural Killer Cell Line NK-92 in Interleukin-2 and Interleukin-15 – Implications for Clinical Trials. Anticancer Research, 2018. 39(1): p. 107-112.
7. Ye, Q.N., et al., Orchestrating NK and T cells via tri-specific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity. Nat Commun, 2024. 15(1): p. 6211.
来源：新浪财经