NIPT全流程自动化测序解析

摘要：下一代测序技术（Next-Generation Sequencing, NGS）凭借其高通量、低成本和广泛的目标检测能力，自2011年起，在临床应用领域崭露头角，并逐步深入到多个医疗领域。尤其在无创产前基因检测（Non-Invasive Prenatal Te

下一代测序技术（Next-Generation Sequencing, NGS）凭借其高通量、低成本和广泛的目标检测能力，自2011年起，在临床应用领域崭露头角，并逐步深入到多个医疗领域。尤其在无创产前基因检测（Non-Invasive Prenatal Testing, NIPT）、新生儿遗传病筛查、罕见疾病的辅助诊断、肿瘤分子分型、肿瘤靶向药物的筛选以及感染病原体的鉴定等方面，取得了显著的进展和广泛的应用。

无创产前基因检测（Non-invasive Prenatal Testing, NIPT）无疑是当前NGS技术在临床应用中最成熟的检测项目之一。它成功开启了无创性产前遗传病检测的新纪元，极大地推动了我国出生缺陷儿的产前预防工作。

无创产前基因检测（NIPT）技术通过母体外周血中游离的胎儿DNA片段，进行精确的测序操作，并借助生物信息学分析手段，揭示胎儿的遗传信息。该技术主要用于筛查三大常见染色体疾病：21三体综合症、18三体综合症和13三体综合症。目前，NIPT技术已进一步升级，推出了NIPT-plus和NIPT 2.0版本，其筛查范围更为广泛，为产前诊断提供了更全面的遗传病学信息。

NIPT的检测流程通常涵盖以下步骤：（1）血液样本的采集与保存；（2）血浆分离，即血液样本的前处理，从全血样本中分离得到上层血浆；（3）DNA提取，即从血浆中提取核酸；（4）文库构建，通常遵循全基因组文库的构建流程；（5）文库质控，确保文库的可靠性；（6）Pooling，即将不同的DNA文库按照一定的规则进行混合；（7）上机测序，即将混合后的pooling文库进行测序操作，从而降低测序成本，提高测序通量；（8）生物信息学分析，即对测序结果进行数据分析。这一系列精确而有序的操作确保了检测的准确性和高效性。

在实验室常规处理流程中，主要包括以下几个环节：血浆分离、DNA提取、文库构建、文库质控、Pooling，随后是上机测序和生物信息学分析。在这些环节中，上机测序前的步骤通常被统称为“湿实验”，这些环节对自动化的需求尤为迫切。

血浆分离

血浆，作为抗凝全血经过离心后获得的上层清液，富含纤维蛋白原及其他凝血因子。由于其保留了血液成分的原始状态，并且产量优于血清，血浆在血液成分检测领域得到了广泛应用。这一特性使得血浆成为临床诊断和研究中的重要样本类型。

为了进行血浆中游离核酸的测序，所需的血浆必须高度纯净，避免母体基因组DNA的干扰。因此，在血浆分离过程中，必须严格避免接触白膜层。同时，为了确保实验的顺利进行，所需的血浆量相对较大，通常需达到500μL-1mL以上（因此，在血浆分离和提取阶段，操作通常采用离心管进行。而到了文库构建环节，由于所需体系体积较小，PCR管成为更合适的选择。这一转换过程，从大体积离心管到小体积PCR管的操作，可能会为实验人员带来一定的操作不便）。

一般推荐的血浆分离方法是两步离心法。孕妇外周血在4℃条件下进行1600×g低速离心10min，吸取上清液转入离心管中，在吸取血浆过程中不能吸到中间层的白细胞及红细胞，然后将上清液16000×g离心10min，吸取上清液至另一个2ml离心管中，避免吸到底层残留细胞。如不慎吸到细胞成分，应将吸取的血浆重新置回管中，重新离心后再进行血浆分离。

分离完的血浆样本可在-20℃暂存1周，应避免反复冻融，可在-70℃以下长期保存。此步骤操作应双人复核标本信息。正常血浆呈透亮的黄色或淡黄色，无明显溶血；如有严重溶血或颜色异常等情形，须登记注明标本状态并重新采血。

痛点分析

在血浆分离过程中，为确保游离核酸测序结果的精确性，必须获得高度纯净的血浆，避免母体基因组DNA的污染。这一过程要求操作人员极为细心，严格避免触及白膜层，这是一项对技术熟练度有较高要求的专业操作，对于初学者而言，具有一定的挑战性。

自动化解决方案

在当前自动化血液样本组分分装领域，已知的有Hamilton EasyBlood高分辨成像血液分装系统，它专长于对离心后的全血样本进行血浆和白膜层的自动识别与分装。此外，Hamilton EasyBlood系统具备与自动化开盖机和二维码阅读模块（Hamilton LabElite IDCapper）的无缝整合能力，能够实现血液样本管条码识别、分层界面识别、吸取、分装、留样以及开关盖等操作的全面自动化。

这款设备我尚未亲自体验，非常欢迎那些已经使用过的朋友们留下您的宝贵意见，分享您的使用体验。

在处理大批量样本时，人工开启样本管盖的操作不仅繁琐，而且极为耗时。因此，采用自动化仪器进行样本管的自动开盖，能够显著提升工作效率，成为更为理想的选择。另外，自动化操作流程中，将血浆直接分装至深孔板，可简化后续的提取步骤，提高实验操作的便捷性和效率。尽管如此，剩余的样本仍需分装至EP管中，以便进行妥善保存。

DNA提取

DNA提取技术多样化，在市场上广泛应用的提取方法主要有磁珠法、硅胶膜离心柱法等。其中，磁珠法在核酸提取过程中表现出较高的自动化兼容性，使得操作更加便捷和高效。

磁珠法核酸提取一般可以分为四步：裂解——结合——洗涤——洗脱。

正如新型冠状病毒肺炎诊疗中新型冠状病毒核酸检测通量高、时效性要求高的特点，对核酸提取技术提出了新的要求——高效、便捷、大通量，原有的手工提取核酸的方法，已经很难满足大规模、高通量的实验要求，在这种背景下，自动化核酸提取应运而生。

磁珠法自动核酸提取技术已达到高度成熟，根据移液特点主要分为磁棒法和移液法两种类型，前者转移的是磁珠，后者转移的是液体。

磁棒法自动核酸提取仪相对应用较多。以ThermoFisher KingFisher Flex系统为例，该设备利用特质的一次性磁套和磁棒进行操作，每批次能够高效处理24至96个样本。

操作流程包括将样本与功能化磁珠及试剂混合后，均匀分配至板孔中。在启动运行时，系统会自动装载磁套。仪器通过磁力作用从溶液中捕获磁珠，随后将其精准释放至含有下一步分离所需试剂的板孔内。这种磁珠的收集与转移机制，确保了洗涤过程的高效性、洗脱步骤的快速性以及整个处理流程的顺畅性。

相对于移液法，磁棒法的优点在于：（1）每一步的液体不会残留，因为磁棒只带走磁珠，然后转移到下一个步骤相应的反应孔中；（2）其编程简单，易维护，机器设备成本更低。

缺点就是不能将手动法磁珠提取试剂直接拿来使用，而需要根据机器特点优化试剂操作。

移液法自动核酸提取仪主要通过移液工作站来实现，如Beckman, Tecan, Hamilton等设备，它利用移液器精确转移液体，以完成核酸的分离与纯化。

相较于磁棒法，移液法的优势体现在：（1）移液过程中有效避免了液体滴落导致的交叉污染；（2）兼容多种磁珠法核酸提取试剂，几乎所有适用于手工操作的试剂均可在该类设备上使用。

然而，这种技术也存在一些不足之处：（1）容易在设备中残留废液，残留的洗涤液中的盐分和乙醇/异丙醇可能会影响后续的洗脱效率和PCR反应的成功率；（2）操作时间相对较长；（3）需要专业的编程和维护，导致设备成本较高，同时移液法在操作过程中消耗大量吸头，使得耗材成本也随之增加。

我个人倾向于认为磁棒法核酸提取仪更好，借用之前交流时群里一位大佬说的话，个人认为总结特别到位。

工作站的移液头移液时，吸头有时会不小心戳到磁珠，这可能会导致产量降低甚至实验失败。而采用磁棒回收磁珠，可以有效避免这类问题。

在磁珠与液体的分离效果方面，磁棒法相较于自动化的磁力架，表现更为出色。移液法由于耗材的吸附力，很难做到不丢失磁珠；而磁棒法只要磁力足够，几乎可以完全避免磁珠的丢失。

磁棒法在酒精晾干效果上也更胜一筹。移液法难以解决死体积问题，而且深孔板的晾干效果更不如磁棒套的敞开式设计。甚至可以发现，使用磁棒套时，几乎不带任何液体，基本无需晾干。

最后，磁棒法的纯化速度也比移液法更快。

PS：暂时未收到相关朋友的反馈NIPT核酸提取过程中的难题，我们诚挚地期待经验丰富的专家和同行们能够慷慨分享，留下您宝贵的见解和建议。

文库构建

文库构建，就是在目标DNA片段的两端连接特定的测序接头，以便于后续进行测序分析。

NIPT通常是全基因组文库的构建，核心步骤是：（i）将目标序列片段化或将目标序列大小调整到所需长度（胎儿游离DNA片段较小，范围在75bp至250bp之间，平均长度为166bp，无需进行额外的片段化处理），（ii）将特定的测序接头连接到目标片段的两端，以及（iii）通过PCR扩增获取足够多能够上机测序的核酸分子（可选步骤）。