摘要：理解高分子材料如何在液体中自组装，相互作用以及如何对环境变化进行响应对于设计药物运输工具，微米/纳米反应器以及人造细胞等领域至关重要。近年来，液相透射电子显微技术（LP-TEM，简称液相电镜技术）在研究软物质科学中展现出巨大应用前景，但是限制该技术在高分子科学

理解高分子材料如何在液体中自组装，相互作用以及如何对环境变化进行响应对于设计药物运输工具，微米/纳米反应器以及人造细胞等领域至关重要。近年来，液相透射电子显微技术（LP-TEM，简称液相电镜技术）在研究软物质科学中展现出巨大应用前景，但是限制该技术在高分子科学常规应用的最大障碍是电子束引发的样品辐照损伤。在液相电镜实验中，高能电子束会引发水的辐解而产生各种高反应活性自由基。这些自由基不可避免地与高分子样品发生反应，导致样品迅速发生交联或分解。所以在液相电镜数据中总是杂糅着辐照损伤带来的副反应，研究者们很难甚至不可能区别哪些数据来自真实反应哪些来自辐照损伤。如何准确解释液相电镜中的软物质样品数据仍是业界一个重大挑战。

近日，荷兰埃因霍温理工大学 (TU/e) 吴杭隆博士（隶属于Jan van Hest教授团队以及TU/e多尺度电镜表征中心，现为MIT博士后研究员）联同荷兰原位电镜设备制造商DENSsolutions以及其他合作者提出能够潜在解决液相电镜中高分子样品辐照损伤问题的可行性方案。文章认为问题的关键不仅仅是缓解样品的辐照损伤，更要理解其辐照损伤的机理。作者定量探讨了聚合物在液相电镜中所有环境中的辐照损伤现象以及其区别，提出并论证利用UV/过氧化氢（UV/H2O2）光辐照过程来在电镜外复现液相电镜中的辐解环境的可行性，同时比较了常见羟基自由基清除剂的效果，最后提出缓解高分子样品辐照损伤的可行性策略。该研究以“Understanding, Mimicking, and Mitigating Radiolytic Damage to Polymers in Liquid Phase Transmission Electron Microscopy”为题发表在《先进材料》上。吴杭隆博士为第一作者和通讯作者。van Hest 教授和表征中心Heiner Friedrich教授为共同通讯作者。该工作也得到DENSsolutions公司Pérez Garza博士、孙宏宇博士、郑鸿奎博士，van Hest课题组邵婧鑫博士、王建洪博士和罗英桐博士以及TU/e李思雨博士的大力支持。

【高分子样品在水蒸汽中的辐照损伤行为】

在液相电镜研究中，样品除了液体环境，也经常暴露在水蒸汽环境甚至真空环境中。而软物质在这些环境下的辐照损伤往往在之前研究中忽视。因此，作者首先探究了样品在真空、水蒸汽以及水蒸汽+异丙醇蒸汽中的辐照损伤行为。作者选用了一种碗状嵌段共聚物囊泡为主要研究对象，通过超低容量点样机器人精确制备液体池芯片样品，然后对这些样品在不同环境下进行低剂量电子束辐照。通过定量图像分析，作者发现在相同的总累积电子剂量下，真空环境中的样品投影面积减少了约7%，水蒸汽环境中的样品收缩接近60%，而在水蒸汽+异丙醇蒸汽环境下，样品投影面积反而增加了16%。这种样品投影面积增加，作者认为与囊泡内部结构塌陷有关。作者进一步通过计算透射电镜图中各囊泡投影面积的像素总强度变化来估算样品的质量变化。结果显示，碗状囊泡在真空、水蒸汽以及水蒸汽+异丙醇蒸汽环境中，分别损失了约6%、61%和23%的质量。同时，作者观察到囊泡周围的像素强度基本保持不变。因此推测，囊泡在与羟基自由基反应后生成的活性聚合物链可能会与水蒸汽中的氧气反应并分解为低分子量羰基化合物。

图1探究高分子囊泡在真空、水蒸汽以及水蒸汽+异丙醇蒸汽中的辐照损伤行为。

图2高分子囊泡在液态水中的辐照损伤行为。

【高分子样品在液态水的辐照损伤行为】

随后，作者探究了高分子样品在不同厚度液态水中的电子束辐照损伤行为。作者首先制备了一些水层大于1微米的液体池。由于水层过厚，最初囊泡在液相电镜中不可见。但随着辐照时间增加，作者观测到多个高衬度的斑块在囊泡双层膜上形成，最终聚合成成一个约90 nm的厚壳。整个囊泡的双层膜的衬度也逐渐从均匀向非均匀转变，最终完全被破坏。随后，作者利用超低容量点样技术和减小氮化硅窗口尺寸的办法制备了水层约600-700 nm的液体池。在低剂量电子束辐照条件下，作者可以在这种液体池边缘得到约5 nm的空间分辨率。作者发现囊泡薄膜上的斑块其实是由5-8 nm的纳米颗粒发展而成，而这些一开始就形成的纳米颗粒也增加了膜的衬度。有趣的是，这些颗粒也会聚集成一些树枝状纳米结构，并在电子束辐照下进一步组装成三维网络。

通过对比水蒸汽和液态水中的实验结果，作者推测液体池环境中的羟基自由基和氧气浓度是决定聚合物损伤行为的重要因素。由于液态水中氧气浓度较低，氢抽提反应得到的聚合物链发生主链断裂的概率会大大降低，因而在液态水实验中聚合物囊泡没有像在水蒸汽中一样逐渐分解成低分子量化合物。作者也通过在液态水中引入气泡来证明这个假设。

图3利用UV/ H2O2光辐照在烧瓶中复现聚合物材料在液相电镜中受到的辐解损伤。

【利用UV/ H2O2光辐照过程来复现电子束造成的高分子样品的辐照损伤】

为能在分子尺度上理解辐照损伤引起的聚合物结构的变化，这就必须要在电镜外复现液体池中观测到的辐照损伤。为此，作者首先提出假设并通过液相电镜实验和动力学建模来确定水辐解产生的羟基自由基对聚合物样品的损伤起决定作用。下一个关键问题是如何在电镜外复现出具有可控羟基自由基浓度的液体环境。为此，作者提出并论证可利用UV/H2O2光辐照过程来产生羟基自由基。通过对比UV/H2O2反应过程和低剂量液相电镜中水辐解机理的相似性，以及定量分析聚合物在两个过程产生的中间产物和最终产物形貌特别是样品的初期损伤行为，确定液相电镜中的聚合物损伤机制可以在UV/H2O2中复现。作者进一步利用色谱以及质谱等技术，确认双亲嵌段共聚物样品在辐照过程中溶解度的降低是由亲水端发生断裂引起的，而观察到的纳米颗粒的形成主要是疏水链的交联所造成。

图3利用羟基自由基清除剂来减缓高分子材料的辐照损伤。

【减缓高分子辐照损伤的策略】

作者随后对比了两种最常见的羟基自由基清除剂（异丙醇以及石墨烯）在保护高分子样品方面的效果。为此，作者制备了两种氮化硅液体池以及一种石墨烯液体池。研究发现，尽管文献中报道5 v%异丙醇具有最佳效果，但其对嵌段共聚物囊泡表面亲水端的保护依然有限。亲水端的破坏直接导致聚合物在水中的溶解度降低，从而引发样品聚集。此外，根据实验结果，作者首次提出石墨烯清除羟基自由基的能力存在距离限制，因此其对样品的保护效果也受限于距离。根据碗状囊泡样品独特的双层膜结构，作者推断40 nm应该是其制备的石墨烯液体池的极限保护距离。为更好理解受样品距离限制的石墨烯保护作用，作者提出未来可以用气压控制的手段来可控地调节石墨烯与样品距离，从而进一步定量理解石墨烯的自由基清除能力。

【小结】

本文系统考察了高分子聚合物材料在液相电镜中特别是低剂量条件下各个环境中的辐照损伤行为。作者定量阐明了聚合物在这些环境中的辐照损伤特性，着重比较了不同浓度氧气和羟基自由基浓度造成的水蒸汽相电镜和液相电镜研究的差异。此外，作者也将液相电镜分析扩展到了晶态有机体系中，利用液相电子衍射观察到各个晶体的损伤路径具有显著差别。更重要的是，本文提出并论证了富含羟基自由基的液相电镜辐解环境可以通过UV/H2O2光辐照反应在电镜外复现，从而在液相电镜辐射化学与宏观体相液体中现有的辐射化学理论之间架起桥梁。最后，本文系统评估了常用羟基自由基清除剂在液相电镜研究中保护聚合物样品的有效性，并揭示石墨烯的保护效果与样品之间距离密切相关。本研究为液相电镜中聚合物的辐解提供了基础性的见解以及有效的缓解措施。这将有助于研究者们开发更合理和有效的液相电镜实验设计，并且将为实时观察高分子聚合物组装体的形状转变、粒子移动性以及药物封装过程提供新的契机，同时最大限度地缓解电子束辐照损伤对液相电镜实验数据的影响。

作者介绍

吴杭隆博士毕业于荷兰埃因霍温理工大学，现为MIT博士后研究员（合作导师为Frances Ross教授以及Yet-Ming Chiang教授）。目前主要研究方向为（1）液相电镜技术（成像、硬件等）开发；（2）液相电镜和冷冻电镜在电化学反应（主要为电池）以及软物质自组装中的应用。迄今在Nature Chemistry, Nature Communications, Advanced Materials, ACS Nano, Small Methods等期刊发文30余篇，文章引用1000多次。

来源：典典说科学