摘要：● 本研究通过联合分析微生物组、代谢组和多因子谱数据，解析动物双歧杆菌乳亚种NJ241缓解结肠炎及其相关生殖损伤的食膳效果和其潜在的作用机制，为开发奶源动物双歧杆菌乳亚种作为膳食益生菌调控肠道及生殖健康提供了重要参考。

膳食补充奶源动物双歧杆菌乳亚种可通过肠-睾轴调控肠炎引发的生殖损伤

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研究论文

●

原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imo2.49

●2025年1月2日，暨南大学陈嘉莉和香港科技大学唐少军等在iMetaOmics在线发表了题为“

Dietary supplementation with milk-derived Bifidobacterium animalis subsp. lactis relieves colitis-linked reproductive disorders via gut-testis axis

● 本研究通过联合分析微生物组、代谢组和多因子谱数据，解析动物双歧杆菌乳亚种NJ241缓解结肠炎及其相关生殖损伤的食膳效果和其潜在的作用机制，为开发奶源动物双歧杆菌乳亚种作为膳食益生菌调控肠道及生殖健康提供了重要参考。

● 第一作者：林静敏、尹龄紫、陈嘉莉

● 通讯作者：陈嘉莉（kellychan123@126.com）、唐少军（shaojuntang@ust.hk）

● 合作作者：范玥瑶、禹志领、马新、符秀琼、张勇

● 主要单位：暨南大学生命科学技术学院、香港科技大学跨学科学院、华东理工大学、香港科技大学（广州）生命科学与生物医学工程学域、香港浸会大学中医药学院、四川大学华西医院疾病系统遗传学研究院

亮 点

● 维持微生物稳态和低内环境炎症水平可改善睾丸精子发生；

● 动物双歧杆菌乳亚种NJ241可有效通过肠-睾轴改善结肠炎相关生殖损伤；

● 阐明了动物双歧杆菌乳亚种NJ241作为潜在益生菌改善男性生殖健康的可行性；

● 为天然发酵乳的未来食膳应用场景提供了新的思考和见解。

摘 要

快速城市化、药物治疗和现代饮食模式是生育力受损面临的主要挑战，缺乏有效的治疗疗法。有研究表明，生殖障碍可能与肠道受损密切相关，或偶尔因药物的副作用而加剧。因此，开发与肠道生殖健康相关的膳食补充剂至关重要。牛奶和乳制品是膳食营养中不可或缺的，并具有潜在的功能活性成分待开发。动物双歧杆菌乳亚种NJ241是从天然发酵乳中分离出来的一株很有前景的潜在益生菌，目前仍待研究开发。本研究旨在探讨NJ241在结肠炎及其相关生殖损伤中的分子作用机制。通过16S rRNA测序和代谢组学联合探讨了生物标志微生物及其相关代谢物，并结合血液分析和组织病理学进行了联合分析鉴定。结果表明，NJ241能有效恢复Claudin-2和MLCK1的表达水平，进而降低肠道通透性。多组学分析结果进一步揭示了NJ241可通过增加Akkermansia muciniphila及其代谢产物trans-ferulic acid的丰度，有效改善肠道屏障完整性。与此同时，通过TLR4信号通路介导有效降低了血清和睾丸组织中促炎因子IL-6的表达水平，进而改善精子质量。微生物群稳态的恢复和炎症水平的系统性降低能有效的改善因肠炎受损的睾丸精子发生。目前研究结果一致阐明了NJ241通过肠睾轴改善肠炎相关生殖障碍的潜在作用途径和机制。此外，NJ241有望作为一种膳食益生菌用于强化乳制品的开发，并为天然发酵乳潜在生殖健康益处提供了有力证据。

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全文解读

引 言

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性特发性炎症性肠病（IBD），会导致结肠粘膜持续反复发炎。虽然IBD可发生于任何年龄，但在育龄期的年轻人中发病率最高，这使得人们对药物的安全性以及疾病对生育和怀孕的潜在影响产生了担忧。不孕症的定义是在至少12个月的定期、无保护性交后仍无法受孕。人们更多地关注女性IBD患者的生育能力，但对男性IBD患者的生殖功能关注较少。然而，与普通人群相比，IBD患者中男性不育症的发病率明显更高。在患有UC的男性中，研究显示精子质量显著下降，包括精子总数减少、存活率降低、运动能力下降和形态正常精子的比例下降。肠道微生物群的健康状况或平衡可能会影响哺乳动物雄性生殖系统的发育和健康。由于多达12%的男性患有不育症和性功能障碍，肠道健康与男性生育能力之间的关联性值得我们更多的关注。此外，已知用于治疗IBD的治疗药物会对男性生育力产生不利影响，因此迫切需要更安全有效的治疗方案。

尽管UC的发病机制尚不清楚，但其发病机制似乎与生态失调有关，生态失调是由共生微生物和病原微生物之间的不平衡导致的肠道微生物多样性紊乱。肠道微生物群通常被视为人类的第二个基因组，对于维持宿主内外环境的平衡至关重要。UC患者通常会出现有益菌减少，如Eubacterium rectale和Akkermansia，而有害菌如Escherichia coli增加的情况。此外，新的证据表明，肠道微生物群失衡可能会影响男性的生育能力。例如，一个饮食代谢紊乱羊动物模型研究表明，肠道菌群失调会降低胆汁酸的水平，破坏脂溶性维生素A在肠-睾轴的运输，进而损害睾丸的精子发生。

研究指出益生菌可通过恢复肠道菌群平衡和抑制肠道炎症来改善UC。这表明，重塑肠道微生物群平衡和肠道代谢可改善UC引起的男性生殖功能障碍。探索肠道微生物群的调节及其代谢产物可能对了解UC的分子机制及其全身影响至关重要。虽然药物治疗仍是治疗多发性硬化症的标准方法，但它们往往与各种不良反应相关。这凸显了探索天然膳食疗法或补充剂的必要性，它们可能会为UC的治疗提供更安全有效的选择。

牛奶是为人类提供了几乎完整的营养成分的哺乳动物的天然分泌产物。研究表明，用牛乳强化母乳可成为婴儿的有效营养补充剂。此外，牛奶中的功能活性成分与改善肠道健康有密切的相关性。鉴定这些生物活性物质对于推进牛奶相关的工业应用至关重要。动物双歧杆菌乳亚种NJ241是一株从天然发酵牛乳中分离出来的潜在益生菌，虽然目前有关NJ241的研究数据有限，但有相关报道指出Bifidobacterium可能可作为一种有效的辅助治疗手段应用于UC。同时，Bifidobacterium也是栖息在人类和动物肠道中的主要重要微生物之一。

目前，肠道微生物群在肠道-血液-睾丸轴中的具体作用仍不清楚。本研究旨在通过对肠道菌群和粪便差异代谢物的联合分析，研究NJ241对结肠炎及其相关生殖疾病的分子机制。这对开发有效的膳食补充剂作为调控肠道及生殖健康的辅助治疗手段具有重要意义。

结 果

NJ241调控结肠炎症和组织损伤

采用2%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液建立小鼠结肠炎模型，以评估NJ241对UC引起的生殖损伤的影响。建立UC模型的方法如图1A所示。诱导结肠组织炎症是成功建立模型的关键标准。如前所述，对苏木精和伊红（H&E）染色的结肠组织切片进行组织学分析，评估包括炎症的严重程度和范围、隐窝损伤和病灶形成等参数。结果显示，对照组小鼠的结肠组织结构完整，而经DSS处理的小鼠结肠组织结构明显受损，表现为隐窝破坏和杯状细胞丢失。值得注意的是，补充NJ241能有效缓解DSS引起的结肠组织损伤，具体表现为减轻了粘膜隐窝损伤，改善了黏膜肌层厚度，减少了中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的浸润，以及抑制了隐窝肉芽肿的形成（图1B）。结肠组织病理学评分证实了NJ241的保护作用，表明它能显著缓解溃疡性结肠炎（图1C）。此外，与DSS处理的模型组相比，NJ241处理的小鼠在第9天体重明显恢复，差异有统计学意义（p

NJ241调控溃疡性结肠炎诱发的生殖损伤

通过测量曲细精管上皮厚度和Johnsen评分来确定结肠炎状态对小鼠睾丸的影响。组织形态学分析表明，与其他组相比，DSS组的曲细精管厚度显著降低，同时伴有明显的管腔空泡化（图1E）。相比之下，补充NJ241能有效缓解这些变化，恢复睾丸形态、曲细精管厚度和Johnsen评分（图1F和G）。

进一步对精子质量进行评估，探讨结肠炎的影响和NJ241的干预效果。分析的参数包括精子数量、形态、活力、存活率和畸形率。结果显示，UC小鼠的精子数量显著减少，畸形精子的比例增加（图2A）。计算机辅助精液分析（CASA）进一步证实了这些观察结果，该分析表明UC小鼠的精子数量、存活率和活力显著下降，精子畸形率增加（p p

图1. 动物双歧杆菌乳亚种NJ241对溃疡性结肠炎（UC）诱导的小鼠雄性生殖损伤症状的影响

（A）结肠炎小鼠模型的实验时间表；（B）组织学分析；（C）整个研究期间每天体重的变化；（D）结肠组织病理学评分；（E）过碘酸希夫（PAS）染色的睾丸切片；（F）和（G） NJ241对曲细精管上皮厚度的影响和Johnsen评分；结果以平均值 ± 标准差（SD)表示（n = 6-8）。用相同字母标记的参数无显著差异。显著性以p

图2. 动物双歧杆菌乳亚种NJ241对UC小鼠精子质量的影响

（A）精子捕获的代表性图像;（B-M）精子分析：精子数量（B）、精子存活率（C）、精子活力（D）、精子畸形率（E）、ALH（F）、LIN（G）、BCF（H）、MAD（I）、STR（J）、VSL（K）、VAP（L）、VCL（M）。结果以平均值 ± SD表示（n = 8）。用相同字母标记的参数无明显差异。ns表示无显著性。ALH：头部外侧位移幅度。LIN，线性度。BCF，节拍交叉频率。MAD，平均角位移。STR，直线系数。VSL，直线速度。VAP，平均路径速度。VCL，曲线速度。DSS，葡聚糖硫酸钠；BL，低剂量NJ241；BH，高剂量NJ241。

NJ241调控炎症表达水平，增强肠道屏障功能

为了评估结肠炎小鼠的免疫反应，进一步分析了血清中多种炎症细胞因子的水平。细胞因子数据的主成分分析（PCA）和聚类分析显示，DSS组的炎症因子特征与对照组有显著差异，而高剂量NJ241处理组（DSS + BH）与对照组非常相似（图3A、B）。此外，通过聚类分析，DSS组的炎症细胞因子谱与其他两组有明显区别。这表明高剂量NJ241可有效抑制炎症细胞因子，与对照组相似（图3B）。虽然大多数细胞因子，包括IL-5、IL-13、IL-10、IL-1β、IL-4、IL-17、IL-17F、IL-21、IL-2、IL-12p70、MIP-3α、TGF-β1、TNF-α和IL-22的水平在各组间无统计学差异（图3C），但与DSS组相比，高剂量NJ241处理组血清中IL-6的产生显著减少。有趣的是，进一步分析发现，与DSS组相比，高剂量NJ241处理组也显著抑制了睾丸组织中IL-6的mRNA表达水平（p

进一步评估了结肠组织中紧密连接蛋白的mRNA表达水平，包括Occludin、ZO-1、Claudin-2和肌球蛋白轻链激酶剪接变体1（MLCK1）。对照组、DSS组和NJ241处理组的Occludin和ZO-1表达水平相当（图4C、D）。然而，与DSS组相比,NJ241处理组显著下调了Claudin-2和MLCK1的表达水平（图4E、F）。这些发现表明，NJ241可通过下调Claudin-2和MLCK1的表达水平有效修复肠道屏障损伤，从而降低肠道通透性。

综上所述， NJ241干预可有效调控全身和局部炎症，特别是通过抑制IL-6的产生，并通过调节紧密连接相关蛋白的表达来增强肠道屏障功能。

图3. 动物双歧杆菌乳亚种NJ241对UC小鼠细胞因子水平的影响

（A）对照组、DSS组和DSS + BH组细胞因子的主成分分析图；（B）对照组、DSS组和DSS + BH组细胞因子的聚类分析；（C）15种代表性炎症细胞因子的浓度。结果以平均值 ± SD表示（n = 4）。用相同字母标记的参数无显著差异。显著性以p

图4. 动物双歧杆菌乳亚种NJ241对睾丸组织和结肠组织中细胞因子和紧密连接相关基因的mRNA表达水平的影响

睾丸组织中IL-6的相对mRNA表达水平（A），以及结肠组织中IL-6（B）、Occludin（C）、ZO-1（D）、Claudin-2（E）和MLCK1（F）的mRNA表达水平。结果以平均值 ± SD表示（n = 4-8）。用相同字母标记的参数无明显差异。显著性以p

NJ241重塑肠道微生物群的多样性和组成

菌群失调是UC的特征之一，肠道微生物群的状态已被证明会影响男性的生殖健康。在这里，我们使用Chao 1指数和观察到的物种指数评估了肠道微生物群的多样性（α-多样性），这两个指数都与样本中物种的丰富度呈正相关。如图5A所示，Chao 1指数和观察物种指数表明，肠道微生物群的多样性在DSS诱导后显著降低（p p

使用非度量多维标度（NMDS）评估了肠道微生物群的相似性（β-多样性）。NMDS分析表明了微生物群落组成的差异，距离越短表示相似性越高。如图5B 所示，NMDS分析清楚地区分了对照组、DSS组、DSS + BL组和DSS + BH组，表明微生物群落组成存在差异。值得注意的是，对照组和低剂量NJ241处理组（DSS + BL）的微生物群落组成具有更高的相似度。此外，LEFSe分析还发现了各组之间不同的系统分型（图5C）。在物种水平上，对照组中富含Clostridium cocleatum，而DSS组中富集的细菌是Advenella faeciporci。在高剂量NJ241处理组（DSS + BH）中，Bacteroides ovatus和Akkermansia muciniphila被鉴定为最丰富的物种。值得注意的是，在目水平上，Pseudomonadales与高剂量NJ241处理在阶次水平上表现出很强的关联性，这可能与精子发生密切相关（图5C）。

这些结果表明，NJ241可以调节被UC破坏的肠道微生物群的多样性和微生物丰富度，表明它在恢复健康的微生物生态系统中发挥作用。

NJ241调控肠道微生物群的代谢

差异代谢物的聚类分析显示，BL组和对照组之间具有高度的相似性，这与微生物群落组成结果一致（图5D）。基于这种相似性，BL组数据被用于差异代谢物分析。差异代谢物的PCA证实，与DSS组相比，BL组和对照组的差异代谢物表现出更高的相似性，这与微生物群落组成结果一致（图5E）。此外，KEGG分析显示，差异代谢物主要富集在D-arginine 和 D-ornithine代谢途径中（图5F）。一些研究还指出，D-arginine 和 D-ornithine代谢可有效抑制UC的炎症反应。此外，该途径的改变还与男性生殖损伤有关。因此，通过影响代谢途径，如D-arginine 和 D-ornithine代谢，NJ241可减少UC相关的炎症反应，并有助于改善精子质量。

图5. 动物双歧杆菌乳亚种NJ241对肠道微生物群的组成和肠道代谢的调控

（A）α-多样性分析；（B）各组的非计量多维标度（NMDS）分析；（C）各组肠道微生物群的LEfSe分析；（D）热图展示组间代谢物的差异。红色代表高水平，蓝色代表低水平；（E）对照组、DSS组和DSS + BL组的PCA图分析；（F）京都基因组百科全书（KEGG）对对照组、DSS组和DSS + BL组差异代谢物的通路富集分析气泡图。

多组学解析NJ241调控溃疡性结肠炎引发的生殖紊乱

采用Procrustes关联性评估肠道微生物群（前10位）、代谢物（前100位）、精子质量和多细胞因子。如图6A和B所示，肠道微生物群与代谢物（ppp = 0.054）（图6C）。此外，还分析了多细胞因子、肠道微生物群、代谢物和精子质量之间的相关性，但没有发现显著的相关性（图6D-6F）。

对肠道微生物群和不同代谢物的联合分析表明，Enterobacteriales、Turicibacterales、Deferribacterales和Anaeroplasmatales等细菌类群与代谢物，包括anabasine，L-lysine，tyrosol， 3-hydroxyphenylacetic acid， 和trans-1,2-cyclohexanediol呈正相关。相比之下，Pseudomonadale与dammarenediol II，4-quinolinecarboxylic acid，和 9,10-DHOME等代谢物呈负相关，而与oxoadipic acid，deoxyinosine，taurocholic acid，和4-pyridoxic acid呈正相关（图6G）。

综合多组学分析表明，NJ241通过调节肠道细菌，尤其是Akkermansia muciniphila及其相关代谢物，缓解了结肠炎诱发的生殖功能障碍，为其潜在作用途径和机制提供了新见解。

图6. 相关性分析解析动物双歧杆菌乳亚种NJ241在调控溃疡性结肠炎引发的生殖紊乱中的潜在互作作用途径

（A-F）对肠道微生物群（前10位）、代谢物（前100位）、精子质量和炎症细胞因子之间关系的Procrustes分析；(G）和（H）热图显示了肠道微生物与不同代谢物在目水平（G）和种水平（H）上的关联。红色表示高水平；蓝色表示低水平。*pppAkkermansia muciniphila与IL-6（I）、IL-12p70（J）和精子畸形率（K）之间的Spearman相关性分析。

讨 论

UC与肠道炎症和微生物生态失调密切相关。大量研究强调了肠道微生物群及其代谢产物在宿主生理过程中的关键作用，包括免疫、代谢、神经和营养平衡。我们之前的研究表明，UC会对男性生殖功能产生不利影响。益生菌能够改善肠道上皮屏障和调节炎症反应，副作用极小，对健康益处显著，因此已成为一种具有应用前景的缓解UC的方法。

本研究旨在探讨NJ241对减轻男性结肠炎患者生殖系统损伤的作用，以及肠道微生物群代谢物促进UC和睾丸保护的潜在机制。如图1所示，NJ241通过减少肠道炎症浸润和恢复肠道结构完整性，显著减轻了体重下降，改善了结肠组织病理学，有效缓解了结肠炎。

男性生育能力评估通常依赖于精液分析，这是准确预测生殖潜力的标准。通过睾丸组织病理学和精液分析，我们再次证实了UC对男性生殖功能的不利影响。值得注意的是，在目前的研究中，NJ241在改善精子质量方面表现显著。先前的研究表明， Lactobacillus rhamnosus CECT8361和Bifidobacterium longum CECT7347等益生菌株能有效改善弱精子症小鼠的精子活力，同时减少DNA断裂和活性氧（ROS）水平。然而，是否可以通过调节肠道微生物群来减轻UC引起的生殖损伤仍是一个未知数。

UC的一个标志性病理特征是持续性结肠炎症，其特点是各种炎症细胞被募集，产生参与UC病理的失调细胞因子。虽然传统上认为UC是一种由T辅助细胞（Th）2介导的疾病，但新出现的证据表明，细胞因子水平因疾病阶段而异。在发病阶段，主要由先天性免疫细胞产生的细胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6尤为丰富。在本研究中，我们检测了结肠炎小鼠的血清细胞因子水平，发现只有 IL-6显著升高。这与许多细胞因子仅限于炎症组织部位、半衰期相对较短、只有在疾病晚期才会出现在血液循环中的可能性相吻合。此外，IL-6及其相关的细胞因子家族在维持代谢平衡方面发挥着重要作用，并与多种胃肠道和肝脏疾病的病理生理学有关，这使它们成为有吸引力的治疗靶标。在这项工作中，我们分析了UC小鼠睾丸和结肠中IL-6的mRNA表达水平，发现IL-6在这两种组织中的相对表达水平均显著升高。这表明持续的结肠炎症可能会通过全身循环影响睾丸功能，从而加剧结肠炎引起的生殖功能损伤。已知IL-6的过度表达会破坏血睾屏障（BTB）的完整性，破坏BTB整体膜蛋白的定位和平衡，并最终损害精子发生。尽管结肠中IL-6 mRNA的表达水平在不同组间没有显著差异，但观察到的趋势与血清分析结果一致，这进一步证实了结肠炎症对生殖健康的系统性影响。

肠上皮紧密连接（TJ）屏障控制着细胞旁通透性，控制着管腔内容物进入肠组织和全身循环的运输。为了进一步阐明肠道炎症与生殖损伤之间的联系，我们检测了结肠TJ相关蛋白的mRNA表达。有趣的是，与之前的研究不同，Occludin 和ZO-1的mRNA水平在不同组间没有显著差异。然而，结肠炎小鼠中Claudin-2的相对mRNA水平呈上升趋势，而NJ241的干预则适度降低了Claudin-2的水平。Claudin-2主要表达于TJ区域和表面结肠细胞的顶端胞质，通过在肠上皮形成阳离子和水选择性通道而参与调节旁细胞通透性。Claudin-2的上调最初出现在 IBD（包括UC和CD）中。值得注意的是，Claudin-2的过表达与通过抑制IL-6诱导的NF-κB通路增强对实验性结肠炎的抵抗力有关，这可能部分解释了本研究中观察到的结肠中IL-6 mRNA水平无显著变化的原因。此外，紧密连接泄漏途径的通透性可由MLCK1调节，MLCK1是屏障功能障碍的关键效应因子和潜在治疗靶点。NJ241可有效下调Claudin-2和MLCK1的mRNA表达水平，这意味着NJ241在调控肠上皮屏障功能方面具有保护作用。Wu等人也认为，服用益生菌可通过降低UC小鼠的Claudin-2水平来改善机械屏障。当肠道通透性增加时，有害物质会进入血液，使免疫系统处于高度警戒状态并导致全身性炎症，这也可能导致精子质量下降。

肠道微生物群在睾丸中发挥着重要作用，可调节BTB的通透性并有助于调节睾丸的内分泌功能。为了研究各组间肠道微生物群的差异，我们采用了α多样性分析和β多样性分析。与Tong等人的研究结果一致，对照组和DSS组的肠道微生物群谱表现出明显的分离，表明结肠炎模型中存在严重的微生物菌群失调。本研究采用LEfSe分析肠道菌群，以确定潜在的生物标记物。我们发现，对照组中富含Clostridium cocleatum。然而，一些研究表明，在结直肠癌模型中，的丰度升高，因此与结肠炎之间的联系尚不明确。此外，还发现UC小鼠体内富含Advenella faeciporci，但其与结肠炎和生殖功能的具体关系尚未阐明。相比之下，BH组富含的Bacteroides ovatus和Akkermansia muciniphila与有益健康的影响有关。这些细菌数量的减少与肥胖、糖尿病和炎症有关。我们推测，NJ241可通过增加Bacteroides ovatus和的数量来抑制肠道炎症。此外，粪便病毒组移植已被证明能刺激增殖，这可能会提高男性的生育能力。有趣的是，Pseudomonadales在BH组中也表现出明显的富集。Pseudomonas的丰度与活动精子总数直接相关。Han等人的研究表明，患有无精子症的男性Pseudomonas丰度减少与核心差异代谢物hexadecanamide之间存在正相关。这些研究结果表明，NJ241能有效调节肠道微生物群，从而提高精子活力。

众所周知，代谢调节对精子发生至关重要。肠道微生物群参与多种宿主代谢途径的调节，这些途径不仅在代谢相关疾病中发挥作用，而且还影响其他系统，如生殖系统。我们的研究显示，低剂量NJ241干预组的差异代谢物与对照组有更高的相似性。KEGG通路分析显示，这些差异代谢物主要富集在D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢通路中。在UC患者的结肠组织中已观察到氨基酸代谢异常。D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢可有效抑制UC的炎症反应。此外，D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢途径中L-精氨酸的改变可能解释了花青素在减轻白消安（Busulfan)诱导的男性生殖损伤方面的积极作用。因此，NJ241可通过靶向干预D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢来调节肠道微生物群的平衡并降低炎症水平，从而改善精子质量。然而，这种调控的具体分子机制还有待进一步研究。

肠道微生物群与宿主相互作用的主要方式之一是通过代谢物，许多研究描述了IBD患者肠道微生物群组成和代谢物谱的改变。在本研究中，我们进行了相关性分析，以探讨肠道微生物群与不同代谢物之间在顺序水平上的关联。与UC小鼠相比，NJ241处理的小鼠体内dammarenediol II，4-quinolinecarboxylic acid，和9,10-DHOME等代谢物减少，而oxoadipic acid，deoxyinosine，taurocholic acid，和 4-pyridoxic acid等代谢物显著增加。

9,10-DHOME是PPARγ的配体，PPARγ可调节脂肪酸代谢和炎症相关基因的表达。PPARγ激活可抑制炎症反应转录因子NF-κB和AP-1。然而，9,10-DHOME 恢复男性生殖功能的确切机制仍不清楚。有研究表明，oxoadipic acid与精子异常呈负相关，而在生精功能障碍的老龄小鼠肠道中，oxoadipic acid的丰度水平较低。因此，在经NJ241处理的小鼠体内观察到的oxoadipic acid水平升高可能有助于改善精子质量。此外，我们还发现3-hydroxyphenylacetic acid (3-HPAA)与Enterobacteriales，Turicibacterales，Anaeroplasmatales和其他微生物的数量呈正相关。先前的研究表明，3-HPAA具有抗氧化和抗凋亡活性，能增强GPX4和NRF2的表达，这表明它能通过调节铁凋亡缓解生精功能障碍。在种水平上，Bacteroides_acidifaciens，Mucispirillum schaedleri和Akkermansia muciniphila与3-HPAA显著相关。LEfSE分析进一步表明，是与NJ241调控结肠炎引起的生殖损伤相关的关键生物标志物。具体而言，与trans-ferulic acid, histamine, D-mannose, and Thymine呈显著相关。Trans-ferulic acid与改善尿毒症和提高精子质量有关。它可由肠道微生物产生并穿过结肠屏障，通过调节TLR4-/IRF3、JAK1/STAT-3/ERK1/2、MAPK/NF-κB-p65和 p-AKT/AKT信号传导，发挥抗氧化和抗炎作用。进一步的Spearman相关分析还表明，与血液细胞因子IL-6和精子畸形率呈正相关。这表明具备促进trans-ferulic acid产生的作用，抑制炎症因子的分泌，从而减轻全身炎症，提高精子质量。

综合多组学和多细胞因子谱数据表明，NJ241可通过调节Akkermansia muciniphila及其代谢产物trans-ferulic acid，显著改善结肠炎引起的生殖障碍。这些发现阐明了NJ241可用于调节肠道微生物群以改善生殖健康的潜在分子途径。

结 论

牛奶是富含多种功能活性成分的天然营养品。动物双歧杆菌乳亚种NJ241是一株从天然发酵乳中分离出来的潜在益生菌，但其特性仍缺少研究。本研究旨在通过分析肠道菌群、代谢组和多细胞因子谱，探讨NJ241在缓解结肠炎及其相关生殖疾病方面的调控效果和潜在作用途径和机制。结果表明，NJ241能有效缓解结肠炎症状，改善精子质量。此外，NJ241还能恢复Claudin-2和MLCK1的表达水平，降低肠道通透性。值得注意的是，NJ241能显著抑制促炎细胞因子IL-6的表达水平，从而调节肠道炎症和代谢平衡。肠道微生物群的LEfSe分析（图5C）还发现NJ241处理组中Pseudomonadales和Akkermansia muciniphila的富集，它们与精子发生和炎症缓解有关。代谢组学分析表明，肠道代谢物在D-arginine和D-ornithine代谢途径中富集，这些过程与精子发生过程中的氧化应激调节密切相关，这表明NJ241可提高精子质量。对肠道微生物群和代谢组学的联合分析表明，Oxoadipic acid、3-hydroxyphenylacetic acid和trans-ferulic acid可能是受NJ241处理影响的代谢物标记。这些代谢物与Pseudomonadales, Enterobacteriales, Turicibacterales, Deferribacterales, Anaeroplasmatales和Akkermansia muciniphila等细菌类群明显相关（图7）。进一步的分析表明，NJ241可通过抑制TLR4信号，并通过调节及其代谢产物trans-ferulic acid来改善睾丸的生精功能。这些发现凸显了NJ241作为一种从天然食品中提取的益生菌的潜力，使其成为营养保健领域的一个有前途的候选应用。此外，这项研究还为天然发酵乳对生殖健康的益处提供了确凿的证据。

图7. 动物双歧杆菌乳亚种NJ241调控结肠炎相关的生殖损伤的潜在作用途径和分子机制示意图

膳食补充从天然发酵乳中分离出的动物双歧杆菌乳亚种NJ241可能通过有效提高肠道Akkermansia muciniphila及其关联代谢物trans-ferulic acid的丰度，和有效下调MLCK1和Claudin-2的表达水平，进而有效降低肠道通透性和促炎细胞因子IL-6在血清和睾丸组织中的表达水平，从而抑制氧化应激、铁死亡、和炎症相关信号通路来改善睾丸精子发生，调控肠炎引发的生殖损伤。

方 法

NJ241的制备与纯化

从天然发酵乳中分离出动物双歧杆菌乳亚种NJ241株（CGMCC No.20816）。收集发酵牛奶样品并稀释，在37℃厌氧条件下用MRS固体培养基进一步培养，获得单菌落。通过基因组DNA鉴定和分析获得动物双歧杆菌乳亚种NJ241，并保藏在中国微生物菌种保藏管理中心。

材料和试剂

动物模型

C57BL/6JNidfc小鼠（雄性，42-55天，20 ± 1 g）来自广东维通利华实验动物技术有限公司。实验前，动物在相对湿度为40-70%、标准光暗周期为12 h、温度为22 ± 1℃的实验室环境中适应7天。动物可自由获取标准饲料和蒸馏水。

病理组织分析

固定后，制备结肠和睾丸组织的4 μm切片。这些切片用H&E和PAS染色。结肠组织病理学评分采用Chen等人所描述的方法。睾丸组织病理学分析包括测量曲细精管的厚度和量化精子发生的Johnsen评分。Johnsen评分是根据Johnsen划分制定的标准，基于精子发生不同阶段生精细胞的形态和数量进行评估的。

精子质量分析

精子质量分析按照之前公布的方法进行。简言之，从左侧尾侧附睾收集附睾精子。安乐死后迅速取出尾侧附睾，置于生理盐水中，用微型剪刀切开。然后将组织在37°C下培养5 min，使精子得以释放。然后将得到的精子样本转移到预热的计数室中，并使用CASA系统进行分析。每个样本至少评估30个视野。

炎症细胞因子测量

安乐死后采集血液样本，在4°C下以3500 g离心15 min。然后收集血清并保存在-80°C，直至进一步分析。按照制造商的说明，使用免疫测定试剂盒分析血清细胞因子水平。

实时荧光定量PCR分析

表1. PCR引物序列

16S rRNA测序

使用通用引物806R和515F扩增16S rRNA基因V3-V4区域。PCR产物在琼脂糖凝胶上显影，使用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化约400-450 bp的条带。纯化的PCR产物在Illumina Novaseq 6000平台上进行测序。使用QIIME（1.7.0版）处理高质量序列读数。相似度 ≥ 97%的序列被聚类为操作分类单元（OTU）。

非靶向代谢组学分析

多组学数据整合

采用Procrustes分析法来评估前10种肠道微生物、前100种代谢物、精子质量和炎症细胞因子之间的显著关联。接着，利用Spearman相关分析来研究代谢物与细菌之间的关系。所有分析和可视化均使用R软件（4.0.2版）和 https://www.omicstudio.cn/tool上的OmicStudio工具进行。

统计分析

所有数据均呈正态分布，以均数±标准差(SD)表示。统计分析采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 26.0版（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）。采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey最小显著差异（LSD）后设文本确定多组间的统计显著性（p

代码和数据可用性

引文格式：

Jingmin Lin, Lingzi Yin, Yueyao Fan, Zhiling Yu, Xin Ma, Xiuqiong Fu, Yong Zhang, et al. 2024. “Dietary supplementation with milk-derived Bifidobacterium animalis subsp. lactis relieves colitis-linked reproductive disorders via gut-testis axis.” iMetaOmics2: e49. https://doi.org/10.1002/imo2.49.

作者简介

林静敏（第一作者）

● 暨南大学食品科学与工程系在读研究生。

● 主要研究方向为益生菌与膳食营养。

尹龄紫（第一作者）

● 香港科技大学（广州）在读博士生。

● 目前研究方向为微生物组学和人工智能交叉，以第一作者(含共同)在iMetaOmics, ACS Nano, Journal of Hazardous Materials, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Antonie van Leeuwenhoek发表论文6篇。

唐少军（通讯作者）

● 香港科技大学广州系统枢纽生命医学与生物医学工程域助理教授、香港科技大学交叉融合学部助理教授、香港科技大学老年疾病研究中心助理教授。

● 博士毕业于美国佛罗里达大学，哈佛医学院博士后，并在美国乔治城大学医学院任助理教授。目前主要研究方向为基因组、蛋白组大数据分析、生物信息软件和数据库开发。在神经退行性疾病，肿瘤，自体免疫病等领域从事广泛的研究。通过基因组、蛋白组、表观组和医学影像等数据的分析研究，解析疾病发生的分子机制。主持国家自然科学基金委、香港老年疾病研究中心、广东省、广州市等研究基金项目。在Nucleic Acids Research、ACS Nano、Journal of Internal Medicine，BMC Medicine、Chest、Research、Mayo Clinic Proceedings等国际期刊发表论文40篇。。

陈嘉莉（第一/通讯作者）

● 暨南大学食品科学与工程系副研究员。

● 目前主要研究方向包括：药食同源功能食品开发、药食同源食膳营养研究、个性化营养、肠道益生菌功能活性研究、天然产物化学及功能性评价等。参编教材《食品营养学》、《食品营养与健康》，以及《益生菌行业白皮书》和《功能食品行业白皮书》。获得第一届全国博士后创新创业大赛金奖，以及全国创新创业优秀博士后荣誉。主持国家省部市级项目4项，参与国家自然科学基金项目3项，发表论文30余篇，以第一/通讯作者在iMeta、Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Food Chemistry等国际期刊发表论文17篇(高被引论文2篇)，申请专利6项(授权5项)。

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期刊简介

“iMeta” 是由威立、宏科学和本领域数千名华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等前沿交叉学科。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括中英双语图文、双语视频、可重复分析、图片打磨、60万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊！相继被Google Scholar、PubMed、SCIE、ESI、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.8，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，是定位IF>10的高水平综合期刊，欢迎投稿！

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