摘要：尽管制药技术已经涵盖了细胞疗法、基因疗法、RNA干扰（RNAi）和CRISPR等创新领域，小分子药物依然是新药研发的核心支柱。在“不可成药”靶点的小分子配体研究领域，关注度持续上升。同时，随着复杂细胞模型的建立，基于表型的药物筛选技术也迎来了复兴。为了加速小分
尽管制药技术已经涵盖了细胞疗法、基因疗法、RNA干扰（RNAi）和CRISPR等创新领域，小分子药物依然是新药研发的核心支柱。在“不可成药”靶点的小分子配体研究领域，关注度持续上升。同时，随着复杂细胞模型的建立，基于表型的药物筛选技术也迎来了复兴。为了加速小分子药物的研发进程，提升表型筛选的通量和效率变得至关重要。
表型筛选瓶颈
常用的高内涵成像或免标记筛选方法对于溶液中细胞或者磁珠的检测显得“力不从心”。另外，针对分泌蛋白（包括趋化因子和细胞因子）的多重检测也难以满足所需的高通量和便捷度。
赛多利斯的iQue高通量流式细胞仪以其独特的高通量悬浮细胞筛选功能，成功填补了小分子药物研发中的这一空白。该仪器具备多通道和多参数的特性，能够快速且轻松地对96、384或1536孔板的大规模文库进行筛选。通过ForeCyt高通量分析软件，iQue流式细胞仪能够自动生成丰富且海量的数据集，迅速确定化合物的优先级，有效推进药物发现流程。以下是iQue流式细胞仪在小分子药物研发中的五大应用，充分展示了其在该领域的卓越性能和重要性。
1、急性髓系白血病治疗药物开发
尽管60%-70%的急性髓系白血病（AML）患者在经历标准诱导治疗后能够实现病情缓解，但大多数患者仍面临三年内的复发风险，且五年的总生存率仅为27%。因此，探索新的AML治疗策略成为了医疗领域迫切需要解决的问题。近期，三项研究均将iQue整合到AML潜在治疗药物筛选的工作流程中，以期发现新的治疗策略。通过利用iQue流式细胞仪的高通量筛选能力，这些研究能够更有效地识别和评估潜在的AML治疗药物，为改善患者预后提供了新的希望。
蒙特利尔大学免疫学和癌症研究所（IRIC）的科研人员发现Mubritinib（一种ERBB2抑制剂）具有很强的在体外和体内抗AML的活性，可通过抑制泛醌依赖性电子传递链（ETC）复合物I的活性而发挥作用。赫尔辛基大学分子医学研究院的科研人员通过iQue流式细胞仪，同时对34个原始AML样本中不同细胞群对7种药物，及27种组合剂量的体外敏感度进行了评估（图1-1）。结果表明，AML样本中的不同细胞群对靶向治疗药物的敏感度存在差异。
随后，他们使用iQue建立了一种高通量流式细胞术，同时监测71种抗肿瘤化合物对多个造血细胞群（表面抗原表达）的剂量反应。通过对比健康细胞和肿瘤细胞（来自AML、多发性骨髓瘤或慢性淋巴细胞白血病患者）的药物反应，发现健康细胞反应能够预测出相应恶性细胞的反应（图1-2）
图1-2. 赛多利斯iQue流式细胞仪在造血细胞免疫表型分析中的应用及门控策略。使用7-AAD和Annexin-V分别对单核细胞的死细胞和凋亡细胞进行排除。根据其核心表面抗原的表达，检测11个细胞亚群（造血干细胞（HSC/CD34+CD38-），普通祖细胞（CPC/CD34+CD38+）。
2、小分子化合物库筛选
FOXP3+ Treg细胞在癌症免疫反应调控中扮演着关键角色，然而，作为Treg细胞核心调节因子的FOXP3，在诱导Treg细胞中的表达并不稳定，且FOXP3调控表达及其对Treg细胞功能的分子靶点尚未明确。能够调节FOXP3及其下游基因如CTLA4表达的药物靶点，具有稳定Treg细胞表型和功能的潜力。阿斯利康IMED生物技术部门的研究人员利用iQue流式细胞仪，开发了一种自动化的384孔板高通量流式细胞术表型实验方法，该方法专用于测定人类Treg细胞中FOXP3和CTLA4蛋白的表达。这一实验流程不仅提高了实验的高通量特性，也增强了流式细胞仪在药物研发中的应用价值。
图2. 使用iQue进行人类Treg细胞扩增、表征和表型筛选。(A）扩增的Treg细胞表达高水平的FOXP3和CTLA4；(B) 扩增的Treg细胞缺乏IL-2的产生；(C, D) 导致FOXP3 MFI增加或减少（C）和导致CTLA4 MFI增加（D）的代表性化合物的柱状图；(E）人类Treg细胞表型筛选简要实验流程，包括Treg细胞的分离、扩增、小分子化合物处理以及细胞活力、FOXP3和CTLA4表达。
3、蛋白激酶抑制剂化合物库筛选
北卡罗来纳大学药理学院的研究人员运用赛多利斯iQue流式细胞仪筛选了一个包含800多种蛋白激酶抑制剂的化合物库，并成功识别出能够在KRAS突变型胰腺导管腺癌（PDAC）细胞系中促进MYC癌蛋白稳定或降解的化合物（图3）。由于KRAS信号通路的激活导致MYC蛋白的稳定性增强，进而推动PDAC的进展，因此，深入理解MYC蛋白稳定性的调节机制对于开发治疗这种极具挑战性的癌症至关重要。通过iQue®流式细胞仪的高通量筛选能力，研究人员能够更精确地识别影响MYC稳定性的化合物，为开发新的癌症治疗策略提供了科学依据。
图3展示了MYC降解筛选的优化过程。(A) 描述了GPS-MYC筛选的流程图。(B) 在这一步骤中，GPS-MYC细胞首先用溶剂（DMSO）单独处理，随后用蛋白酶体抑制剂MG132或蛋白合成抑制剂CHX处理6小时，最终在iQue流式细胞仪上进行分析。所收集的数据基于每个对照组的前两孔和后两孔，分别对应实验的起始（0分钟）和结束（45分钟）时刻。(C) GPS-MYC筛选实验是成对进行的。数据经过归一化处理，对照组DMSO（蓝色圆圈，表示0%稳定性）和MG132（绿色圆圈，表示100%稳定性）被用作参照，以两个重复实验的30%平均稳定性为界线确定筛选命中率。代表筛选命中的圆圈以紫色显示，圆圈的大小与每孔的事件数成正比。在图中，评估出的稳定化化合物被特别标出。(D) 与(C)的流程相同，不同之处在于对照组为DMSO（蓝色圆圈，表示0%失稳）和CHX（红色圆圈，表示100%失稳）。在图中，评估出的不稳定化合物也被特别标出。通过iQue®流式细胞仪的应用，研究人员能够精确地分析和评估化合物对MYC蛋白稳定性的影响，这对于筛选出潜在的抗癌药物候选物至关重要。
4、揭示小分子BH3模拟物抗癌机制
抑制癌细胞的抗凋亡机制也是一种极具前景的治疗方法。小分子BH3模拟物能够模拟BH3蛋白，抑制抗凋亡蛋白促细胞生存的功能，从而诱导癌细胞凋亡。要成为真正的BH3模拟物，就必须满足2个标准：
需要直接在已知抗凋亡依赖性细胞的线粒体上发挥作用；
2、直接且选择性抑制具有高亲和力的抗凋亡蛋白。
来自美国丹娜法伯肿瘤医院的科研人员开发了一套能够综合分析BH3模拟候选物，并进行高通量活性测试的方法。iQue®在此方法主要用于进行活性测试。
5、确定去铁酮（DFP）的抗增殖机制
最近，佐治亚理工学院的研究人员通过iQue 流式细胞仪的研究确定了去铁酮（DFP）的抗增殖作用机制。DFP是一种由美国食品药品监督管理局（FDA）在2011年批准上市的口服铁螯合剂，以其对铁的高亲和力而能有效控制体内的铁负荷。研究揭示，DFP的抗增殖活性主要归因于其对铁依赖的组蛋白赖氨酸脱甲基酶（KDM）亚群的抑制作用。此外，研究人员还发现了基于DFP的新型KDM抑制剂，这些抑制剂显示出对癌细胞系更强的细胞毒性。在小鼠异种移植模型中，一种先导化合物被证实能有效抑制乳腺肿瘤的生长。在这项研究中，所有涉及流式细胞仪的实验测试均由iQue流式细胞仪完成，为研究提供了精确的数据分析和细胞表型评估。
为什么iQue流式细胞仪在小分子药物开发中被广泛认可？
更快的高通量筛选：96孔板分析仅需5分钟，384孔板分析仅需20分钟；
节约成本，加快研发速度：每个孔中采样 1 µL，节省了试剂成本，保存了有限的样本；
为悬浮细胞的高通量筛选赋能：对免疫调节剂或复杂的混合细胞（如 PBMC）的分析进行优化，并以单细胞的分辨率生成每种细胞类型的数据；
智能的数据分析处理：ForeCyt软件是基于微孔板整板分析的大型数据集，包括内置标准曲线和独特功能（如 Profile Map）的数据分析和可视化工具，数据可轻松导出到您的电子实验室笔记本系统。
来源：PM讲科学
