摘要：近日，中国药科大学董廖斌课题组联合复旦大学李付琸课题组在微生物工程助力杂萜天然产物高效合成领域取得重要突破。该团队通过系统的代谢工程和酶工程策略，成功突破了关键手性砌块的规模化制备瓶颈，将drimane型手性砌块的微生物发酵产量提升至克级水平。基于获得的手性砌

导读

近日，中国药科大学董廖斌课题组联合复旦大学李付琸课题组在微生物工程助力杂萜天然产物高效合成领域取得重要突破。该团队通过系统的代谢工程和酶工程策略，成功突破了关键手性砌块的规模化制备瓶颈，将drimane型手性砌块的微生物发酵产量提升至克级水平。基于获得的手性砌块，团队进一步实现了多个具有生物活性的杂萜天然产物的高效简洁合成。该研究成果以"Microbe engineering to Provide Drimane-Type Building Blocks for Chiral Pool Synthesis of Meroterpenoids"为题发表在国际知名期刊Angewandte Chemie International Edition上（https://doi.org/10.1002/anie.202419463）。

正文

杂萜天然产物是一类结构多样、生物活性广泛的复杂天然产物，目前已发现超过500个化合物（图1A）。其中，pyripyropene C对酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶（ACAT）表现出强效的抑制活性（IC50为53 nM），zonarol (1)具有神经保护作用，ent-(+)-chromazonarol (2)是一个针对农作物病原菌的潜在防治药物，mycoleptodiscin A (3)表现出中等的抗菌活性，而pelorol (4)对真菌表现出优异的抑制活性（EC50为7.7 μM）。这些化合物均以drimane骨架（蓝色标注部分）与非萜类部分形成独特的杂合结构，在药物开发和农业应用方面展现出良好的开发潜力，然而其高效合成一直是一个重要挑战。

图1. 杂萜天然产物及其合成策略. (A) Drimane骨架及代表性的含drimane骨架杂萜天然产物（DMT），包括pyripyropene C、zonarol (1)、ent-(+)-chromazonarol (2)、mycoleptodiscin A (3)和pelorol (4)，其中drimane核心结构以蓝色标示; (B) DMT的传统合成策略，包括侧链降解手性合成子法和立体选择性多环化法; (C) 本研究开发的结合微生物工程和化学合成的集成策略用于DMT的简洁合成。

传统的杂萜天然产物合成策略主要依赖两种方法（图1B）：立体选择性多环化和手性合成子法。立体选择性多环化方法往往步骤冗长，且在关键的生物模拟环化步骤中立体选择性难以控制。而手性合成子法虽然立体化学明确，但主要依赖植物来源的香紫苏内酯或香紫苏醇作为起始原料，需要3-6步的侧链降解反应才能获得目标C15中间体，这不仅降低了原子经济性，也影响了整体合成效率。

近年来，研究发现drimenol (5)和albicanol (6)这类drimane型化合物可以作为替代性手性砌块，它们能够与芳基卤代物直接偶联，无需碳链降解过程，为杂萜天然产物提供了更为简洁的合成途径。然而，这些C15化合物在自然界中含量极其有限，且以往报道的异源生产方法产量普遍较低，例如在烟草叶片中表达PhDS基因获得的drimenol产量仅为392 μg/g鲜重，而在酵母中生产albicanol需要4L培养基和96小时发酵才能获得8.3 mg产物。这种低效的生产方式严重限制其作为手性砌块的进一步开发。

面对这一关键瓶颈问题，研究团队开发了综合的微生物工程策略（图1C）。该策略首先利用“人工两步法”PhoN-IPK系统来提供萜类前体，这一系统可以将外源添加的五碳醇DMAA/ISO直接转化为五碳焦磷酸前体IPP和DMAPP，显著简化了传统MVA或MEP途径（图1C）。在此基础上，团队通过两个关键策略来提升目标产物的产量：策略1引入生物合成通路中Nudix水解酶从而提高产物滴度；策略2则通过对PhoN-IPK系统中关键磷酸化酶PhoN进行理性设计和改造从而提高底物转化效率。

在初始阶段，研究团队首先对drimenol合酶进行筛选（图2A）。通过对比SsDMS、ScDMS和CavC三个来源不同的drimenol合酶，发现它们的产量差异并不显著（13-15 mg/L）。由于II型萜类环化酶产生的中间产物带有焦磷酸基团，研究人员猜测大肠杆菌内源水解酶的低效率可能是限制产量的关键因素。进一步对drimenol生物合成基因簇分析发现，SsDMS上游存在Nudix水解酶（SsNDH）。经实验证实，引入SsNDH后产量显著提升至63 mg/L。

图2. Drimenol生产的优化策略. (A) 三种不同来源的细菌drimenol合酶产量比较; (B) SsNDH-SsDMS融合蛋白构建示意图。单酶、分离酶单元和具有不同长度linker的融合蛋白(n=0-4)，插图显示了连接linker的组成; (C) 不同酶排列方式和融合构建体(n=0-4)对drimenol产量的优化; (D) 优化后的SsNDH-SsDMS融合蛋白的结构预测模型，其中SsNDH（粉色）通过柔性linker（蓝色）与SsDMS（橙色，显示β和γ亚基）相连。

为了进一步优化催化效率，团队设计了不同的酶表达方式（图2B）。考虑到空间邻近性可能有助于底物传递，研究人员构建了SsNDH-SsDMS融合蛋白。通过AlphaFold2预测的结构显示，两个酶的活性位点可以通过柔性linker连接实现良好的空间布局。在对linker长度进行优化后（图2C），产量进一步提升至111 mg/L。预测的融合蛋白结构（图2D）清晰地展示了SsNDH（粉色）和SsDMS（橙色）通过柔性linker（蓝色）形成的空间排布。

图3. PhoN的工程化改造. (A) 含活性位点口袋的PhoN同源模型。插图：与DMAP相距4Å内的关键残基; (B) 图A中选定残基的丙氨酸扫描结果; (C) 电荷改变突变的静电表面修饰，野生型vs突变体; (D) 带电突变对产量的影响; (E) 按进化保守性着色的PhoN表面展示图; (F) PhoN同源序列的序列标识，方框内标出突变靶点; (G) 基于保守性指导的突变对产量的影响。

尽管通过融合蛋白策略显著提升了产量，但111 mg/L的产量仍难以满足实际应用需求。团队注意到在整个反应过程中，PhoN催化的可逆磷酸化和水解反应可能是另一个关键的限速步骤。通过结构分析（图3A）发现，PhoN的活性位点由K133、R140、S166、G167、H168、R201、H207和D211等残基组成。对这些位点进行丙氨酸扫描发现突变后产物几乎完全丧失（图3B），证实了这些位点的重要性。

基于PhoN催化可逆磷酸化反应的特点，研究团队提出了一个提高催化效率的新思路：通过在活性口袋附近引入正电荷，增强酶与磷酸基团的相互作用。通过对DMAP和PhoN的分子对接实验，团队选择了位于配体4Å范围内的E122、G125、L158和I171进行定点突变。结构预测显示（图3C），在不同位点引入精氨酸或赖氨酸会产生不同的效果：E122R/K突变在底物进入的关键位置显著增加了正电荷，而G125R/K突变虽然增加了电荷但可能会阻碍活性口袋，L158和I171作为内部残基，带电突变对口袋表面电荷的影响较小。随后的实验结果完全符合这一预测：E122R突变使产量提升至178 mg/L（提高1.6倍），而G125R/K变体产量严重下降（分别为17和9 mg/L），L158和I171位点的突变也导致产量显著降低（均低于10 mg/L）。这种将结构预测与实验验证相结合的系统方法，清楚地证明了在活性口袋附近战略性地引入正电荷可以显著提高磷酸化效率。

为了进一步优化PhoN的催化效率，团队转向了共进化分析策略。通过分析500个与PhoN序列相似度超过80%的酸性磷酸酶序列，利用EMBL-MUSCLE进行多序列比对和ConSurf WEB SERVER进行保守性分析，将氨基酸残基按保守程度分为九个等级（图3E）。在距离活性口袋12Å范围内，团队识别出六个非保守残基：S90、Y135、K153、T157、R160和I222（图3E-F）。这些残基在进化过程中表现出较高的可变性，暗示它们可能是潜在的优化靶点。通过将这些非保守残基替换为更具保守性的氨基酸，团队设计了十个PhoN变体。发酵实验显示，S90G、T157K和R160K突变使drimenol产量较野生型提高了约1.2倍。这一结果表明，在漫长的进化过程中，这个酶家族确实倾向于进化出更稳定和更高效的形式。

更为可喜的是，当将带电突变（E122R）与进化分析获得的有益突变（T157K和R160K）组合时，产生了显著的协同效应。最优的三突变体E122R/T157K/R160K使drimenol产量达到了398 mg/L，较初始产量提升了27倍。为了解释这种显著提升的分子机制，团队成功解析了PhoNE122R/T157K/R160K的晶体结构（PDB: 8YC1，图4B-C）。与野生型PhoN相比，三突变体的等电点从6.08升至7.72，表明表面正电荷显著增加。更重要的是，分子动力学模拟（图4D）揭示突变体能够与配体维持长达40 ns的稳定相互作用，相比于野生型PhoN稳定作用时间延长了近20 ns，这可能是其催化效率提升的关键原因。

在取得drimenol生产的重要突破后，研究团队开始评估其在合成中的应用。然而，在初步尝试drimenol碘代物与芳基碘代物的镍催化还原偶联反应时，由于β-H消除反应的发生，主要得到二烯产物。这一结果促使团队转向探索albicanol，其碘代物在Weix条件下能够与不同的芳基卤代物顺利发生偶联。基于这一设想，研究团队将优化后的PhoN-IPK系统应用于albicanol的生产。通过将SsDMS替换为来自Antrodia cinnamomea的环化酶AncC，初始产量即达到281 mg/L。

为了进一步提高albicanol的产量，研究团队对发酵条件进行了系统优化。通过调控IPTG浓度（0.05 mM）、甘油浓度（2%），以及优化ISO的添加策略，在摇瓶水平将albicanol产量提升至1805 mg/L。更为重要的是，在5L发酵罐中采用两阶段补料策略，即在OD600达到30时开始补料，当albicanol达到1.6 g/L时追加8 g ISO，最终使产量提升至3.5 g/L（图4E），创造了微生物发酵生产albicanol的最高水平。

图4. PhoNE122R/T157K/R160K的结构分析和albicanol生产优化. (A) 策略1和策略2中突变组合对drimenol产量的影响; (B) PhoNE122R/T157K/R160K的晶体结构（PDB ID:8YC1）; (C) 野生型PhoN（灰色）和PhoNE122R/T157K/R160K（蓝色）的结构比对。插图：与DMAP作用的突变残基; (D) 野生型PhoN和PhoNE122R/T157K/R160K与DMAP的分子动力学模拟，显示RMSD值; (E) Albicanol发酵过程曲线，显示OD600、葡萄糖消耗和albicanol产量随时间的变化。插图：albicanol结构。

有了充足的drimane手性砌块供应后，研究团队开始探索其在杂萜类天然产物合成中的应用。团队通过镍催化的还原偶联反应（图5A），建立了一系列杂萜类化合物的简洁合成路线（图5B）。这包括zonarol (1)的3步合成（总收率66%），ent-(+)-chromazonarol (2)的4步合成（总收率65%），mycoleptodiscin A (3)的6步合成（总收率22%），以及pelorol (4)的6步合成（总收率14%）。

图5. 以albicanol为手性砌块的DMT发散合成. (A) Albicanol (6)与芳基卤代物(8)的镍催化还原偶联反应; (B) Zonarol (1)、ent-(+)-chromazonarol (2)、mycoleptodiscin A (3)和pelorol (4)的手性合成子合成路线。

总结

中国药科大学董廖斌课题组联合复旦大学李付琸课题组针对杂萜类天然产物简洁高效合成问题，创新性地将微生物工程与化学合成相结合，建立了一套完整的交叉学科技术体系。研究团队通过系统的酶工程改造和结构生物学研究，成功突破了手性砌块规模化制备的瓶颈，并在分子水平阐明了“人工两步法”体系中酸性磷酸酶的催化机制。这一发现不仅为后续开发更高效的drimane型手性砌块生物合成体系提供了理论基础，也为解决其他萜类化合物的生产难题提供了新思路。更重要的是，该研究为天然产物全合成领域提供新颖的研究范式：通过微生物工程获取关键手性砌块，继而通过灵活的化学转化实现目标分子的高效简洁合成。这种策略避免了传统全生物合成中需要组装复杂酶促级联反应的困难，同时也克服了有机全合成中手性源获取困难和步骤冗长的问题，将显著加速杂萜类生物活性分子的发现和药物开发进程。

文献详情：

Microbe engineering to provide drimane-type building blocks for chiral pool synthesis of meroterpenoids.

Wenyu Du, Zhongyu Cheng, Xingming Pan, Chenhao Liu, Mingyu Yue, Tianhao Li, Zhixi Xiao, Lu-Lu Li, Xuelan Zeng, Xiaoxu Lin, Prof. Fuzhuo Li, Prof. Liao-Bin Dong

Angew. Chem. Int. Ed.2025

DOI：10.1002/anie.202419463

来源：化学加