摘要：表观遗传修饰在多种生物和病理过程中起着关键作用，其中5-甲基胞嘧啶（5mC）被认为是肿瘤发生和进展的早期分子事件，并已成为一个非常有前景的生物标志物。近年来，5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）作为5mC的氧化产物，在正常哺乳动物生长和发育中也扮演着重要角色，并与癌症

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表观遗传修饰在多种生物和病理过程中起着关键作用，其中5-甲基胞嘧啶（5mC）被认为是肿瘤发生和进展的早期分子事件，并已成为一个非常有前景的生物标志物。近年来，5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）作为5mC的氧化产物，在正常哺乳动物生长和发育中也扮演着重要角色，并与癌症和神经疾病等疾病相关，显示出作为癌症诊断理想生物标志物的巨大潜力。然而，由于5hmC水平比5mC低约14倍，且其结构与C和5mC相似，使得5hmC的定量检测更具挑战性。

近日，上海交通大学生物医学工程学院彭小焕博士为第一作者、徐宏研究员为通讯作者在《Analytical Chemistry》期刊发表题为“Fragment-specific Quantification of 5hmC by qPCR via a Combination of Enzymatic Digestion and Deamination: Extreme Specificity, High Sensitivity, and Clinical Applicability”的科研成果，研究建立了一种名为EDD-5hmC的5hmC定量方法，该方法通过结合酶切（Enzymatic Digestion）和生物脱氨（Deamination）策略，利用qPCR平台实现对片段特异性DNA序列中5hmC的极高特异性、高灵敏度和临床适用性的定量分析。该方法首次在结直肠癌组织和配对的癌旁组织中检测了5hmC水平，以评估其区分结直肠癌的能力，结果显示单基因Septin9的ROC曲线下面积高达82.8%，Septin9和Syndecan-2（SDC2）组合的ROC曲线下面积为83.6%，表明EDD-5hmC方法是一种具有临床应用前景的准确定量5hmC水平的方法。深圳易基因科技为本研究提供靶基因DNA羟甲基化检测（AmpACE-seq）技术服务。

标题：Fragment-specific Quantification of 5hmC by qPCR via a Combination of Enzymatic Digestion and Deamination: Extreme Specificity, High Sensitivity, and Clinical Applicability（通过结合酶切和脱氨作用的qPCR对5hmC片段特异性定量检测：极高特异性、高灵敏度和临床适用性）

期刊：Analytical Chemistry

日期：2025-1-13

技术平台：扩增子APOBEC偶联DNA羟甲基化测序（ACE-seq）、qPCR等（易基因金牌技术）

准确鉴定和定量5hmC有助于阐明其在基因表达和疾病发病机制中的功能，目前的5hmC分析方法在临床应用中，存在假阳性结果的风险以及灵敏度不足的问题。本研究建立了一种靶向片段特异性DNA序列的5hmC定量方法，该方法具有极高的特异性、高灵敏度和临床适用性——EDD-5hmC检测法，该方法通过酶切富集糖基化的5hmC，然后利用APOBEC（载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样）介导的脱氨基作用，有效区分各种胞嘧啶（C）修饰状态，实现了极高特异性的5hmC定量，使非特异性扩增减少8M倍。此外，EDD-5hmC检测法的非破坏性生物处理过程表现出高灵敏度，最低检出限(Limit of Detection,LOD)达到30 aM。研究人员利用该方法首次检测了结直肠癌组织和匹配的癌旁组织中的5hmC水平，以评估其区分结直肠癌的能力，单基因Septin9的受试者工作特征曲线下面积高达82.8%，Septin9和Syndecan-2（SDC2）组合的曲线下面积为83.6%，表明EDD-5hmC检测法是一种具有临床应用前景的准确定量5hmC水平的方法。

研究摘要

研究方法

研究中基于ACE-seq分析提出的EDD-5hmC方法包括四个步骤：

（1）通过T4-β-葡萄糖转移酶（T4 BGT）和尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-葡萄糖）反应，对5hmC进行高效无损伤的葡萄糖基化，生成5ghmC；

（2）应用葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶敏感的限制性内切酶（GSREs）消化C和5mC，富集完整的5ghmC目标；

（3）通过APOBEC脱氨基将C和5mC转化为尿嘧啶（U），而5ghmC仍被读作C；

*以上3步骤均为ACE-seq测序的基本原理

（4）使用特异性引物和TaqMan探针结合并扩增5ghmC以产生荧光信号。该方法基于qPCR平台，通过酶切和脱氨基的双重作用，有效地区分5hmC与C和5mC，确保了极高的特异性和灵敏度。

研究结果

ACE-seq在本研究中的作用

ACE-seq（amplicon APOBEC-coupled epigenetic sequencing）在本研究中用于确定HCT116细胞中与Septin9和SDC2相关的5hmC信息，以及EGFR基因片段的5hmC状态。这些信息对于选择特定的DNA片段进行EDD-5hmC分析至关重要，确保研究中所使用的DNA片段具有高DNA甲基化富集区域，与结直肠癌（CRC）强相关。通过ACE-seq获得的数据为EDD-5hmC方法的验证和应用提供了准确的5hmC修饰信息，从而提高研究的准确性和可靠性。

重要图形

（1）AmpACE-seq表征EGFR基因片段的5hmC状态

为了检验EDD-5hmC检测法对实际样本的可行性，选择三种模型样本进行验证：未甲基化的HCT116 DKO gDNA（双敲除）、甲基化的HCT116 gDNA和人类大脑基因组。首先选择在人类大脑基因组中富含5hmC的表皮生长因子受体（EGFR）基因作为目标基因，对选定检测片段的基因组进行CpG岛预测，并通过（amplicon APOBEC偶联表观遗传测序）AmpACE-seq对EGFR基因片段的5hmC状态进行表征。测序结果显示，EGFR片段（chr7:55082610−55082724，称为EGFR gene 68635）在人类大脑基因组中高度富集（平均44.56%），而在未甲基化的HCT116 DKO gDNA和甲基化的HCT116 gDNA中含量较低（平均分别为0.18%和0.66%）。

图1：用于EDD-5hmC检测的候选EGFR位点。

（2）AmpACE-seq确定HCT116细胞中目标位点对应的5hmC信息

通过AmpACE-seq确定了HCT116细胞中位点对应的5hmC信息，最终选定的序列片段为chr17:77373342−77373437、chr8:96494093−96494215和chr8:96494039−96494111，分别命名为Septin9、SDC2 313和SDC2 239，这些片段位于研究团队先前研究中鉴定的高DNA甲基化富集区域，与结直肠癌（CRC）强相关。

图2：EDD-5hmC检测法中使用的Septin9（A）、SDC2 313（B）和SDC2 239（C）的最终选定位点。

（3）EDD-5hmC检测法对Septin9和SDC2的分析性能和临床诊断性能

为了评估EDD-5hmC检测法的灵敏度，通过2倍系列稀释HCT116基因组DNA来评估已建立检测法的分析性能，其中羟甲基化DNA的理论input拷贝数通过AmpACE-seq获得的5hmC比例计算得出。分析结果表明，对于Septin9、SDC2 313和SDC2 239，随着羟甲基化DNA浓度降低，Ct值逐渐增加。羟甲基化拷贝数与Ct值之间的关系分别为R²=0.99、R²=0.99和R²=0.95，这突出了EDD-5hmC检测法的定量分析能力。

使用含有10、10和30个拷贝/反应的Septin9、SDC2 313和SDC2 239羟甲基化DNA的样本，进行了20次重复检测，以研究已建立检测法的LoD。结果表明在20次重复反应中，Septin9、SDC2 313和SDC2 239呈阳性的概率分别为95%、100%和100%，表明Septin9、SDC2 313和SDC2 239的检测灵敏度分别约为10、10和30个拷贝/反应，得出的LoD约为30 aM，高于先前报道113.7 aM灵敏度的5hmC检测方法。因此，本研究建立优化后的EDD-5hmC检测法表现出高灵敏度、特异性、稳定性和可重复性。

图4：EDD-5hmC检测法对Septin9和SDC2的分析性能。

易小结

EDD-5hmC检测法的建立，能够在qPCR平台上以极高的特异性和高灵敏度准确定量特定片段的5hmC水平。该方法显著减少了假阳性信号，提高了检测灵敏度，实现了约30 aM的最低检出限（LoD）。同时，该方法首次证明了检测单个基因Septin9中的特定5hmC片段作为CRC的新表观遗传生物标志物的巨大潜力，其AUC高达82.8%。未来，通过扩展其应用到其他疾病和研究更多标志物，EDD-5hmC方法可能为与5hmC水平差异相关的疾病提供有效的临床检测和验证研究的新工具。

关于易基因ACE-seq羟甲基化测序技术

APOBEC-coupled epigenetic sequencing（ACE-seq）技术是一种全新的鉴定5hmC的方法。DNA脱氨酶APOBEC3A(A3A)能够特异地脱去C及5mC的氨基使其变为U，而5hmC则因为不被该酶识别，测序时仍被识别为C。该技术利用该酶的这种特性，特异性地检测基因组上发生的5hmC修饰。ACE-seq原理示意如下：

（1）利用β-葡糖基转移酶（βGT）将5hmC加上葡糖基，转变成5ghmC，5ghmC不会被A3A酶脱氨基。

（2）利用A3A酶特异去除C和5mC的氨基，使其转变成U，而5hmC保持为C，从而将5hmC和C/5mC区分开来。

ACE-Seq具有以下优势：

(1)检测范围为全基因组。可以得到基因组上大部分C位点的羟甲基化水平。

(2)单碱基分辨率。能够检测单个C碱基的羟甲基化水平，精确度高。

(3)低起始量。ACE-Seq利用脱氨酶实现5hmC与C及5mC的区分，反应条件温和，不破坏基因组，大大减少基因组DNA的损失，因此起始DNA量比常规的oxBS技术降低100倍。

(4)高准确性。绝大部分甲基化修饰的C都被转化成U，而绝大部分经过糖基化修饰的5hmC（5ghmC）则保持为C，表明该技术具有充分的可靠性。

(5)经济性。仅需一个文库解决问题，羟甲基化研究成本大大降低。

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化、cfDNA）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA与蛋白互作）、DNA与蛋白互作及染色质开放性技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。

参考文献：

Peng X, et al. Fragment-specific Quantification of 5hmC by qPCR via a Combination of Enzymatic Digestion and Deamination: Extreme Specificity, High Sensitivity, and Clinical Applicability. Anal Chem. 2025 Jan 13. doi: 10.1021/acs.analchem.4c05147. PubMed PMID: 39804214.

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来源：易基因科技