易基因：RRBS揭示中药材滇重楼DNA甲基化变化及花粉调控种子休眠的表观遗传机制

摘要：滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）是一种著名的中药材，其花药在花粉成熟后表现出独特的周期性开裂和闭合的生理特性。其种子具有“次生休眠”特性，导致发芽率低、繁殖效率差。种子休眠受植物激素（如赤霉素和脱落酸）含量及比例影响

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滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）是一种著名的中药材，其花药在花粉成熟后表现出独特的周期性开裂和闭合的生理特性。其种子具有“次生休眠”特性，导致发芽率低、繁殖效率差。种子休眠受植物激素（如赤霉素和脱落酸）含量及比例影响，而这些激素的合成基因表达又受温度、光照和种子含水量等因素调控。此外，滇重楼的花药在花粉成熟后会出现独特的周期性开裂和闭合现象，但这种现象对种子休眠的调控机制尚不清楚。

近日，昆明学院农学与生命科学学院王斌教授团队通过RNA测序和DNA甲基化测序，比较了花粉和种子在花药开裂与闭合过程中的基因表达和甲基化变化，并结合不同花粉授粉模型，分析了这些变化对种子休眠的调控机制。相关研究成果以“Exploring the potential of Paris polyphylla var. yunnanensis pollen manipulation in modifying seed dormancy”为题发表在《Frontiers in Plant Science》期刊。深圳市易基因科技为本研究提供DNA甲基化测序（RRBS）技术服务。

研究人员结合RNA测序（RNA-seq）和简化基因组DNA甲基化测序（RRBS）技术，分析了花药开裂和闭合过程中花粉和种子的基因表达谱以及甲基化变化，并研究了低温处理后的影响。通过KEGG通路富集分析，鉴定出温度相关甲基化变化敏感的基因簇（clusters）。

研究设置四种花粉处理模型：正常对照组、“低温保护花粉”组、“刚开裂花药的花粉”组和“闭合阻断花药的花粉”组，通过人工授粉产生相应的种子。随后利用qRT-PCR技术验证在不同处理条件下，授粉种子中标记基因表达模式变化。

通过转录组分析，研究者鉴定出花药与正常组织之间的差异显著表达基因，以及与低温处理花粉和种子相关的甲基化变化基因区域。氧化磷酸化（ko00190）、植物激素信号转导（ko04075）和玉米素生物合成（ko00908）三条信号通路表现出显著的基因表达和甲基化变化富集。尤其是NADH-泛醌氧化还原酶链5、质膜ATP酶4、细胞色素c氧化酶亚基2、玉米素-O-葡萄糖基转移酶、ABA不敏感蛋白5类似蛋白4和吲哚-3-乙酸酰胺合成酶（IAAS）等被鉴定为易受温度诱导的甲基化变化影响的基因簇。

不同花粉授粉模型的评估结果显示，IAAS、蔗糖合成酶（SUS）、赤霉素2-氧化酶（GA2ox）、ABA不敏感蛋白2（ABI2）和生长素抑制蛋白（ARP）这五个与休眠调控相关的标记基因在闭合阻断花药的花粉、低温保护的花粉以及刚开裂花药的花粉三种情况均表现出差异表达模式。闭合阻断花药处理导致IAAS、SUS、GA2ox和ABI2的表达显著上调，而ARP表达则显著下调，这表明闭合阻断花药处理倾向于延长种子休眠期。而在低温保护的花药模型中，SUS、ARP、GA2ox和IAAS的表达水平降低，ABI2表达上调，总体上促进种子萌发。

研究方法及结果

样本收集：滇重楼的花药、花粉粒和种子

研究方法及结果：

转录组分析：发现花药开裂和闭合状态的基因表达存在显著差异，闭合花药中基因表达水平更高，且与能量代谢和植物激素信号转导相关的基因显著富集。DNA甲基化分析：对不同处理的花粉和种子进行RRBS分析，检测DNA甲基化变化。RRBS结果显示，低温处理的花粉和种子中，氧化磷酸化、植物激素信号和玉米素生物合成等通路中的基因易发生甲基化变化。基因表达与甲基化的关联分析：低温处理导致花粉和种子中某些基因的甲基化水平发生变化，进而影响其表达水平。例如，NADH-泛醌氧化还原酶链5（ND5）、质膜ATP酶4（AHA4）和细胞色素c氧化酶亚基2（COX2）等基因在低温处理后表达上调，而IAA-酰胺合成酶（IAAS）等基因表达下调。花粉处理模型对种子休眠的影响：通过人工授粉实验发现，不同处理花粉模型（如低温保护、阻止花药闭合等）显著改变了种子中与休眠调控相关的基因表达模式，如SUS、ARP、IAAS、GA2ox和ABI2等基因的表达水平发生变化，进而影响种子的休眠与萌发。

RRBS在本研究中发挥关键作用

检测DNA甲基化变化：RRBS用于分析低温处理对花粉和种子基因组DNA甲基化的影响，揭示了氧化磷酸化、植物激素信号等通路中的基因甲基化变化。关联基因表达与甲基化：通过RRBS分析，研究者发现低温处理导致的甲基化变化与基因表达的调控密切相关，如ND5、AHA4和COX2等基因的甲基化水平变化与其表达上调一致，而IAAS等基因的甲基化变化则与其表达下调相关。揭示环境因素对基因调控的影响：RRBS结果表明，低温作为一种环境因素，可以通过改变花粉和种子中特定基因的甲基化状态，进而影响其表达，从而调控种子的休眠与萌发，为理解环境因素对植物基因表达和发育的调控机制提供了重要依据。

关键结果图形

本研究采用RRBS分析滇重楼花粉和种子的全基因组甲基化情况，构建的滇重楼RRBS文库经亚硫酸盐处理，非甲基化C到T的转化率超97%。测序分析结果显示，经过4°C低温处理的花粉（4-H）和25°C处理的花粉（25-H）分别产生46.68 Gb和34.22 Gb的数据，而经过-85°C处理的种子（85-Z）和4°C处理的种子（4-Z）分别产生71.76 Gb和74.4 Gb的数据（表1）。

表1：低温处理花粉和种子甲基化测序结果的质控数据

图1：从转录组比较中差异表达基因富集的KEGG通路与差异DNA甲基化基因富集的通路重叠。
A. 开花药组（T1–T3）与正常组织（T12–T15）的差异基因富集分析显示，最显著KEGG通路是植物激素信号（Ko04075）。
B. 闭花药组（T4–T6）与正常组织（T12–T15）的差异基因富集分析表明，最显著KEGG通路是淀粉和蔗糖代谢以及氧化磷酸化（Ko00190）。
C. 开花药组（T1–T3）与闭花药组（T4–T6）的差异基因富集分析表明氧化磷酸化（Ko00190）是最显著KEGG通路。
D. 4°C和25°C不同温度处理的花药甲基化差异基因富集分析表明，最显著KEGG通路是氧化磷酸化（Ko00190）。
E. -85°C和4°C不同温度处理的种子甲基化差异基因富集分析表明氧化磷酸化（Ko00190）是最显著通路之一。
F. 转录组和甲基化分析中富集的重叠通路分析表明，影响花粉发育基因表达的关键酶因温度下降而发生甲基化变化，这与种子的行为一致。
酶1（enzyme1）：NADH-泛醌氧化还原酶链5；酶2：质膜ATP酶4；酶3：细胞色素c氧化酶亚基2；酶4：玉米素-O-葡萄糖基转移酶；酶5：ABA不敏感蛋白5类似蛋白4；酶6：吲哚-3-乙酸酰胺合成酶。

表2：低温处理种子和花粉中 Methyl-Diff 基因和代谢通路的重叠分析。

图2：花粉和种子中易发生甲基化变化的基因可能通过农业和生物学中的信号通路影响种子休眠。

图3：验证受精种子中花粉表达变化的基因

易小结：研究亮点

揭示花药开裂与闭合的基因表达差异：首次系统地分析了滇重楼花药开裂和闭合状态下的基因表达差异，发现闭合花药中与能量代谢相关的基因表达显著上调。低温对花粉和种子甲基化的调控机制：明确了低温处理通过改变花粉和种子中特定基因的甲基化水平，进而影响其表达，为理解环境因素对种子休眠的调控提供了新的视角。花粉处理对种子休眠的调控作用：通过不同花粉处理模型，证实了花粉的生理状态和环境处理可以通过改变种子中关键基因的表达模式来调控种子的休眠与萌发，为滇重楼的人工繁殖提供了新的思路。

关于易基因简化基因组甲基化测序（RRBS）研究解决方案

简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

为适应科研技术的需要，易基因进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。

为助力适用低起始量DNA样本（5ng）量多维度甲基化分析，易基因开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向基因组测序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和微量样本复用检测，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞基因组CG位点覆盖高达15M以上。

技术优势：

起始量：100ng gDNA；单碱基分辨率；多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域，数据利用率更高；针对性强，成本较低；基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。

应用方向：

RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：

队列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究模式动物发育和疾病甲基化研究

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化、cfDNA）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA与蛋白互作）、DNA与蛋白互作及染色质开放性技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。

参考文献：

Wang M, Wang Q, Wang X, Wang D, Yin X,Qiao Y, Ma M, Du Y and Wang B (2024) Exploring the potential of Paris polyphylla var. yunnanensis pollen manipulation in modifying seed dormancy.Front. Plant Sci. 15:1389357.doi: 10.3389/fpls.2024.1389357