摘要：芳香亲核取代（SNAr）反应是一类非常重要的有机反应，广泛应用于药物分子、农用化学品和聚合物合成之中。如图1a所示，SNAr反应能够对（杂）芳环进行官能团化，即缺电子（杂）芳基卤化物亲电试剂与碳、氧、氮或硫亲核试剂进行偶联便可模块化构建相应的C-C和C-X（X

芳香亲核取代（SNAr）反应是一类非常重要的有机反应，广泛应用于药物分子、农用化学品和聚合物合成之中。如图1a所示，SNAr反应能够对（杂）芳环进行官能团化，即缺电子（杂）芳基卤化物亲电试剂与碳、氧、氮或硫亲核试剂进行偶联便可模块化构建相应的C-C和C-X（X=O、N、S）键。然而，由于缺乏有效和通用的SNAr反应催化剂，该领域仍存在一定的局限性。此外，现有的SNAr化学方法与立体选择性和/或区域选择性过程不相容，这在构建复杂分子时会带来巨大的麻烦。为了解决这些问题，化学家利用小型有机氢键或相转移催化剂开发了少量的对映选择性SNAr反应，但是这些有机催化剂的效率十分有限，并且对新型底物兼容性不高。自然界中，酶凭借其高效的活性和精准的立体控制引起了化学家的广泛关注，不过目前还尚未报道过天然酶介导的选择性和汇聚性SNAr反应。虽然4-氯苯甲酰-CoA A脱卤酶、5-硝基邻氨基苯甲酸氨基水解酶和阿特拉津氯水解酶被认为通过SNAr途径起作用，但其机制涉及金属-氢氧化物中间体或共价芳基酯的水解，进而表明上述酶仅适用于水作为亲核试剂。

近日，英国曼彻斯特大学的Igor Larrosa和Anthony P. Green等研究者报道了一种立体选择性芳香亲核取代反应（SNAr）的生物催化方法。他们在一个含活化精氨酸的工程酶中发现了混杂的SNAr活性，经过连续几轮定向进化进行活性优化之后获得了一种高活性的工程化生物催化剂SNAr1.3，比亲本酶效率高160倍并能以近乎完美的立体控制（>99% e.e）实现缺电子芳烃与碳亲核试剂的偶联。SNAr1.3的反应速率高达0.15 s-1、TON高达>4000。此外，机理、结构和计算研究表明Arg124和Asp125残基形成的卤化物结合口袋在催化中具有关键作用。相关成果发表在Nature上。

图1. 芳香亲核取代（SNAr）反应及对映选择性SNAr酶的定向进化。图片来源：Nature

首先，作者选择2-氰基丙酸乙酯（1）和2,4-二硝基氯苯（2）为模板底物、Morita-Baylis-Hillman（MBH）酶家族为SNAr亲本酶对SNAr反应条件进行优化（图1b），初步研究表明变体BH32.8（SNAr1.0）能以痕量的转化率（3%）和立体选择性（~5% e.e.）促进SNAr反应。为了提高活性和选择性，作者对SNAr1.0进行了几轮定向进化（图1c），发现包含六个突变的SNAr1.3变体（图1e）能以93%的转化率和96% e.e.值获得唯一产物 (R)-3（其绝对构型通过X-射线衍射确定）。特别的是，在进化过程中，作为MBH催化中的关键亲核体His23发生突变，进而排除该残基通过亲核催化促进SNAr反应的可能性。此外，动力学分析表明：1）在固定浓度2（2.5 mM）和可变浓度1下进行的测定表明kobs显著提高了160倍（图1d），而KM1的变化很小；2）在饱和浓度1下进行的后续测定也显示kcat/KM2增加了160倍。值得注意的是，从PBS缓冲液切换到磷酸钠缓冲液后，SNAr1.3的活性增加了3倍，这主要是由于氯化物浓度升高会抑制酶的活性（IC50=147±32 mM）。此外，碘化物也是SNAr1.3的更有效抑制剂，其IC50值为1.20±0.05 mM。

图2. 卤化物离去基对SNAr 1.3活性的影响。图片来源：Nature

随后，作者探索了卤化物离去基团对SNAr1.3活性和选择性的影响（图2a），结果显示与芳基氯化物2相比，芳基溴化物（4）和芳基碘化物（5）作为底物时酶活性分别提高了3.8倍和8.6倍（图2b）。当使用芳基碘化物5（1 mM）进行反应时，SNAr1.3可以8.81±0.11 mM-1min-1的速率进行并以>99% e.e.值获得产物3，特别是该酶能够实现>4000次的周转循环（图2c）。值得一提的是，仅用0.5 mol% SNAr1.3便可以>99%的转化率、91%的分离产率和99% e.e.值获得150 mg规模的(R)-3。此外，作者发现SNAr1.3具有区分区域异构芳基卤化物的潜力，即对3,5-二硝基溴苯无反应活性，而对2,6-二硝基氯苯（6）具有良好的反应活性（99% e.e.），尽管对6的活性比用于酶工程化的2,4-二硝基氯苯区域异构体2低~170倍。需要指出的是，1与2和6的等摩尔混合物进行反应时以优异的产率（97%）和区域选择性（r.r.=71:1）获得产物3，这进一步证明了SNAr过程的区域选择性。

图3. 底物拓展。图片来源：Nature

在最优条件下，作者对亲电试剂的底物范围进行了考察（图3a），结果显示含有不同官能团（如：氰基、三氟甲基、酯基、酮羰基、砜取代基以及吡啶环）的硝基芳烃（3-16）均能兼容该反应，以中等至优异的产率和对映选择性获得单一的SNAr产物。类似地，多种碳基亲核试剂（如：含有较大酯基（17、18、19）、酰胺基（20）、2-烷基取代基（21、22）、环状β-酮酯（24、25））和氧基亲核试剂（如：苯酚（26）、活性醇（27和28））均能顺利地转化为相应的C-C键和C-O键偶联产物，特别是SNAr1.3可催化2-硝基丙酸乙酯的C-芳基化，从而成功构建含氮四元立体中心（23），并且所得的α-硝基酯产物可进一步转化为有价值的手性砌块（如：α-氨基酸和α-叔胺）。其次，SNAr生物催化剂还可用于构建1,1-二芳基季碳骨架。对一系列SNAr变体进行筛选后，作者发现工程化变体SNAr1.2可有效催化芳基氯化物2和苯基氰基乙酸乙酯29的SNAr反应并以27%的产率和46% e.e.值获得产物30（图3b）。进一步对SNAr1.2进行突变后获得双突变体SNAr Ph1.0，其活性是母体酶的3倍并且能以84% e.e.值获得产物30。值得一提的是，当使用芳基碘化物5作为底物时能以96%的产率和87% e.e.值获得产物30，并且该酶也可以生成1,1-二（杂）芳基化产物31和32，不过立体选择性有所降低。

图4. 机理研究。图片来源：Nature

为了进一步探究反应机理，作者进行了一系列实验，具体而言：1）在无亲核偶联试剂的条件下，将SNAr1.3及其它变体与芳基卤化物5一起培养并检测卤化物释放和蛋白质质量随时间的变化，结果显示在测定条件下没有观察到芳基卤化物水解产生的酚类产物，并且不会积累任何共价中间体，进而说明酶-底物共价中间体不太可能参与SNAr1.3催化过程；2）在冷冻前用100 mM KI浸泡SNAr1.3晶体，所得结构揭示了两个内部碘化物结合位点，其中Met64、Arg65、 Arg124、Asp125和Pro128占用了最多的位点（~85%，图4a），特别是Arg和Asp残基是天然蛋白质中卤化物结合位点的共同特征；3）将底物5浸泡SNAr1.3晶体后，所得结构显示出两个明显的异常信号，此信号与碘化物取代基密切相关，进而表明底物结合具有相当大的构象异质性，特别是卤化物5的取代基直接放置在上述卤化物结合腔附近（图4b），使得其芳基底物下方有一个可容纳亲核偶联试剂的空腔；4）在结构分析的指导下，对卤化物结合位点的残基进行定点诱变后，作者发现R124A和D125N/A突变分别导致速率大幅下降180倍和68/22倍，M64A和R65A的速率下降幅度较小，这说明卤化物结合位点对高效催化的重要性；5）对SNAr1.0和SNAr1.3结构进行比较可以看出卤化物结合口袋是如何通过定向进化进行调控，特别是W88R突变导致Arg65重新定位以优化其与Asp125的静电相互作用（图4c）。虽然M64A、R65A和D125A卤化腔突变保留了高水平的选择性（图4d），但R124A突变导致对映体选择性显著降低，进而表明Arg124也可能在定位和/或活化亲核试剂1进行选择性催化中发挥作用，分子动力学模拟支持了这一结果，即模拟显示1的烯醇化物与Arg124形成氢键相互作用的构象。

总结

本文报道了一例不对称芳香亲核取代反应的生物催化方法。该酶SNAr1.3经过连续几轮的定向进化获得，其比亲本酶效率高160倍并对缺电子芳烃与碳亲核试剂的SNAr反应具有近乎完美的立体控制（>99% e.e）。机理实验表明Arg124和Asp125残基形成的卤化物结合袋对于该反应具有重要的作用。

Engineered enzymes for enantioselective nucleophilic aromatic substitutions

Thomas M. Lister, George W. Roberts, Euan J. Hossack, Fei Zhao, Ashleigh J. Burke, Linus O. Johannissen, Florence J. Hardy, Alexander A. V. Millman, David Leys, Igor Larrosa, Anthony P. Green

Nature, 2025. DOI: 10.1038/s41586-025-08611-0

来源：X一MOL资讯