摘要：显微镜作为科学研究和日常实验中的重要工具,其种类繁多,各具特色。本文旨在探讨显微镜的主要分类及其特点,以更好地辨别和选择适合自身需求的显微镜类型。通过介绍光学显微镜、生物显微镜、双光子显微镜、消色差物镜和共聚焦显微镜五种典型显微镜,本文详细分析了它们的原理、应

摘要：显微镜作为科学研究和日常实验中的重要工具,其种类繁多,各具特色。本文旨在探讨显微镜的主要分类及其特点,以更好地辨别和选择适合自身需求的显微镜类型。通过介绍光学显微镜、生物显微镜、双光子显微镜、消色差物镜和共聚焦显微镜五种典型显微镜,本文详细分析了它们的原理、应用领域及优缺点,为显微镜的选择和使用提供了参考。

一、光学显微镜

光学显微镜(Optical Microscope,简写OM)是一种用光学原理,把肉眼所不能分辨的微小物体放大成像,以供人们提取微细结构信息的光学仪器。2022年奥林巴斯科学事业部独立,成立EVIDENT公司,提供了DSX系列、OLS系列 、FV系列、VS系列等显微镜产品,广泛应用于电子元件、金属材料、半导体制造、生物学、医学等领域。

显微镜是一种精密的光学仪器,已有300多年的发展史。自从有了显微镜,人们看到了过去看不到的许多微小生物和构成生物的基本单元——细胞。不仅有能放大千余倍的光学显微镜,而且有放大几十万倍的电子显微镜,使我们对生物体的生命活动规律有了更进一步的认识。大部分实验观察工作要通过显微镜来完成,因此,显微镜性能的好坏是做好观察实验的关键。

DSX系列是一款功能强大、适应多种观察需求的数码显微镜,广泛应用于多个领域,如汽车制造、精密设备、电子元件、材料科学等。

还有OLS系列3D激光共焦测量显微镜,专为失效分析和材料工程研究设计,将出色的测量精度和光学性能与智能工具相结合,使显微镜的使用更加方便。

另外FV系列激光扫描共焦显微镜利用光学原理将微小物体放大成像,以供科研人员提取微细结构信息,广泛应用于神经科学、生物学、医学等领域,以及农业、石油、交通、制药、综合、材料等领域。

而VS系列研究级全玻片扫描系统更是一款集高通量、高速度、高分辨率于一体的显微镜成像系统,专为科研工作者在大脑、神经科学、植物研究、发育生物学、肿瘤微环境等领域提供高效的成像解决方案。

结构组成

光学系统

显微镜的光学系统主要包括物镜、目镜、反光镜和聚光器四个部件。广义的说也包括照明光源、滤光器、盖玻片和载玻片等。

(一)物镜

物镜是决定显微镜性能的最重要部件,安装在物镜转换器上,接近被观察的物体,故叫做物镜或接物镜。

物镜的放大倍数与其长度成正比。物镜放大倍数越大,物镜越长。

如MXPLFLN系列,数值孔径大、图像平整度高、工作距离长,有助于于明场、微分干涉对比(DIC)、荧光和简单偏光等多种应用下获取高质量的图像。

UPLXAPO系列,数值孔径大、图像平整度高,色差补偿范围广,有助于明场、荧光、共聚焦和超分辨率显微镜等多种应用获取高分辨率、明亮的图像。

物镜的分类

物镜根据使用条件的不同可分为干燥物镜和浸液物镜;其中浸液物镜又可分为水浸物镜和油浸物镜(常用放大倍数为90–100倍)。

根据放大倍数的不同可分为低倍物镜(10倍以下)、中倍物镜(20倍左右)高倍物镜(40–65倍)。

根据像差矫正情况,分为消色差物镜(常用,能矫正光谱中两种色光的色差的物镜)和复色差物镜(能矫正光谱中三种色光的色差的物镜,价格贵,使用少)。

光学显微镜有多种分类方法,按使用目镜的数目,可分为三目、双目和单目显微镜;按图像是否有立体感,可分为立体视觉和非立体视觉显微镜;按观察对象,可分为生物和金相显微镜等;按光学原理,可分为偏光、相衬和微分干涉对比显微镜等;按光源类型,可分为普通光、荧光、红外光和激光显微镜等;按接收器类型,可分为目视、摄影和电视显微镜等。常用的显微镜有双目连续变倍体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、紫外荧光显微镜等。双目体视显微镜是利用双通道光路,为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置,两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角,以此形成三维空间的立体视觉图像。双目体视显微镜在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术;在工业领域用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。

奥林巴斯的数码显微镜、激光共聚焦显微镜、测量显微镜、金相显微镜、生物显微镜等广泛应用于生命科学领域及工业领域的多种类显微镜设备。

二、生物显微镜

1. 按照定位级别分类。可以分为学生级、实验级、研究级生物显微镜。2022年奥林巴斯科学事业部独立,成立EVIDENT公司后,继续提供CX系列、BX系列、FV系列、VS系列研究级全玻片扫描系统、APX100等涵盖符合各种需求的显微镜产品。

2. 按照目镜的个数分类。可以分为单目型、双目型、三目型生物显微镜。

3. 按目镜和移动台的相对位置分类。可以分为正置生物显微镜和倒置生物显微镜。正置(常规)生物显微镜的物镜在移动台的上方,倒置生物显微镜的物镜在移动台的下方。

4. 按成像原理分类。可以分为光学生物显微镜和电子生物显微镜。

光学显微镜主要由目镜、物镜、载物台和反光镜(集光镜)组成。目镜和物镜都是凸透镜,焦距不同。物镜的凸透镜焦距小于目镜的凸透镜的焦距。物镜相当于投影仪的镜头,物体通过物镜成倒立、放大的实像。目镜相当于普通的放大镜,该实像又通过目镜成正立、放大的虚像。经显微镜到人眼的物体都成倒立放大的虚像。

三、双光子显微镜

新型双光子显微镜带有的超高灵敏度的直接探测器能记录组织深层最细微的内部结构。支持多色的多光子实验,再结合高速扫描头和最大扫描视野,将轴向位移减至最小,有效地收集来自深层组织的微弱光子,使图像更明亮,将对标本的光毒性减至最小。

如2022年奥林巴斯科学事业部独立,成立EVIDENT公司后,推出的FV4000MPE显微镜通过集中激发光功率来有效激发样品深处的荧光染料,从而获得更明亮的图像。先进的NDD SilVIR探测器具有更大的光束检测直径,可以更好地收集样品深处的散射荧光。

双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是:在高光子密度的情况下,荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子,在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后,发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度,为了不损伤细胞,双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脉冲宽度只有 100 飞秒,而其频率可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时,物镜的焦点处的光子密度是最高的,双光子激发只发生在物镜的焦点上,所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔,提高了荧光检测效率。FV4000MPE显微镜以突破性的SilVIR探测器作为多光子成像系统的核心,可以实现更低噪声、更高的灵敏度和更强的光子分辨能力。该系统具有高速捕获活体深层动态变化过程的能力,可满足苛刻研究应用的需求。同时,该系统配置灵活,具有多模态升级的空间,可扩展如单双一体或者其他定制化应用功能。

双光子荧光显微镜有很多优点:

1.长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本;

2.焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面,使激发光可以穿透更深的标本;

3.长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小;

4.使用双光子显微镜观察标本的时候,只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以,双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。

5.FV4000MPE的NDD探测器最多可配置六个通道,用于多色多光子成像。实现对样品更深入的穿透和更精确的成像,特别适用于观察厚组织或细胞内部的结构和功能。同时还配备激光扫描系统能快速、准确地扫描样品表面,并生成高分辨率的图像,有助于捕捉样品中的微小变化和快速事件。共振扫描单元可快速获取大体积3D图像。

四、消色差物镜

消色差物镜(Achromatic objective): 这是常见的物镜,外壳上常有“Ach”字样。这类物镜仅能校正轴上点的位置色差(红,蓝二色)和球差(黄绿光)以及消除近轴点慧差。不能校正其它色光的色差和球差,且场曲很大。

消色差物镜是指能够减少或消除因不同波长光线在透镜中折射不同而产生的色差的物镜。在显微镜观察中,由于白光是混合光,不同波长的光在透镜中的折射不同,这会导致观察到的图像出现颜色偏差。消色差物镜通过特殊的设计和材料选择,能够显著减少这种色差,提高成像的清晰度和准确性。其中,奥林巴斯消色差物镜是显微镜中重要的光学部件,如UPLXAPO系列、MPLAPON系列、MXPLFLN系列,以优异的成像质量和广泛的应用领域而备受推崇。

消色差物镜的特点

高清晰度:奥林巴斯消色差物镜采用先进的光学设计和高精度制造工艺,能够提供清晰、细腻的成像效果,有助于用户更准确地观察样本细节。

消色差性能优异:通过特殊的光学材料和镀膜技术,奥林巴斯消色差物镜能够有效减少色差,使得观察到的图像颜色更加真实、准确。

多种倍率选择:奥林巴斯消色差物镜提供多种倍率选择,如4X、10X、20X、40X、50X、100X、150X等,以满足不同观察需求。不同倍率的物镜适用于不同的观察对象和观察目的。

平场设计:部分奥林巴斯消色差物镜还采用平场设计,可以在整个视野范围内保持清晰度和对焦一致性,使得观察更加准确和方便。

耐用性强:奥林巴斯消色差物镜采用优质材料制造,具有良好的耐用性和稳定性,长期使用不易出现失真或损坏。

消色差物镜的应用领域

奥林巴斯消色差物镜广泛应用于生物医学、材料科学、环境科学等领域。

在生物医学领域,被用于观察细胞、组织等微观结构,帮助医生和研究人员更准确地诊断疾病和研究生命现象。

在材料科学领域,被用于观察材料的微观结构和性能,为材料研究和开发提供有力支持。

在环境科学领域,被用于观察微生物、污染物等微小物体,为环境保护和治理提供重要依据。

使用注意事项

在使用奥林巴斯消色差物镜前,请确保物镜表面干净,避免灰尘或污垢影响成像质量。

避免将物镜暴露在高温、潮湿或腐蚀性环境中,以免影响其使用寿命和性能。

使用时请轻柔操作,避免碰撞或摔落,以免损坏物镜。

镜头表面应定期清洁,可使用专门的镜头清洁液和柔软的镜头布轻轻擦拭。

镜头不适宜接触任何化学溶剂或强酸碱,以免腐蚀表面。

五、共聚焦显微镜

共聚焦显微镜一般分为共聚焦激光扫描显微镜(CLSM),以及转盘共聚焦显微镜(SDCM)

共聚焦激光扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)是近十多年研制成的高光敏度、高分辨率的新型仪器。它以激光为光源,由共聚焦成像扫描系统、电子光学系统和微机图像分析系统组成。光束经聚焦后落在样品(组织厚片或细胞)不同深度的微小一点,并作移动扫描,通过电信号彩色显像,可使样品内任何一点的反射光形成的图像,都被准确地接收下来并产生信号,传递到彩色显示器上,再连接微机图像分析系统进行分析处理 [2]。自2022年奥林巴斯科学事业部拆分、独立成立EVIDENT公司后,提供满足各行各业特定共聚焦显微镜需求的解决方案,如OLS系列、FV系列、SpinSR不仅继承了传统激光共聚焦显微镜的高分辨率、三维成像等优势,还通过一系列创新设计和技术升级,进一步提升性能和易用性。广泛应用于电子半导体、机械制造、材料学、分子细胞生物学、遗传学、形态学、医学、药理学等领域。

转盘共聚焦显微镜(SDCM)是为了解决单针孔扫描共聚焦成像速度较慢的问题,以应对活标本的高速成像的需求。Mojmir Petran和Milan Hadravsky于1965年10月搭建了第一台多针孔面成像显微镜。他们将针孔安置在旋转盘面上,并以阿基米德螺线(Archimedian spiral)的方式排布,通过旋转盘转动即可完成全帧扫描。这样的设计允许科学家对大尺寸、厚标本进行高帧率的共聚焦成像。在系统成型之初,由于系统光效率较低,且缺乏诸如弧光灯、激光等照明技术,Petran和Hadravaky不得不把显微镜搬到海拔2632米的塔特拉山(Tatra Mountain),以在阴天获得宝贵的阳光作为照明光源。随着激光技术的广泛应用,以及上世纪90年代中后期,日本Yokogawa公司使用微透镜技术显著增加激发光到达标本的效率,高帧率、高信噪比的共聚焦成像才得以实现。文献:Wilson,T.(2012).Twenty-five years of confocal microscopy.

EVIDENT公司生产的奥林巴斯品牌SpinSR超高分辨转盘共聚焦显微镜上的高灵敏度 sCMOS相机可以轻松地对整个视野区域进行面成像,无需逐点扫描, 大幅提升采集速度,使研究人员能够观察到高速动态的生物学现象。

共聚焦显微镜的工作原理

激光扫描共聚焦系统的光源为离子激光器或HeNe激光器,光源发出的激光束通过照明针孔后成为点光源P。点光源P通过分束器进入高数值孔径显微物镜的成像系统成像后,在部分透明的被测样品内形成像点P。从像点P发出的散射光及反射光(波长为λ1)和其他荧光(波长λf>λ1),反方向经过物镜和分光镜后,入射到单点探测器。单点探测器由探测器和放置在探测器前的针孔组成,它可以减少探测器的有效面积。探测器一般使用的是光电倍增管或雪崩光电二极管,探测器接收到的电信号最后由计算机进行处理 。

①如果激光束聚焦点的直径小于针孔的直径,则P处的针孔可以去掉 。

②有些材料能自发荧光,有些材料则需要用合适的染料上色 。

奥林巴斯FV系列激光扫描共聚焦显微镜以激光作为光源,逐点激发样品内荧光,采用精密针孔滤波技术,有效抑制了非聚焦平面的杂散光,从而获得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。这种技术具有层析成像能力和很高的成像信噪比,是分子细胞生物学等领域的重要研究工具。而奥林巴斯的OLS系列激光共聚焦显微镜采用405 nm激光二极管光源和高灵敏度光电倍增管获取共聚焦图像。能够获得出色的横向分辨率。浅焦深特性使其能用于测量样品的表面不规则性。在材料表面粗糙度评估和电子部品(如半导体和EV电池)的质量检测领域有着十分广泛的应用。

转盘共聚焦显微镜一般搭建于包括带有高分辨率物镜和目镜的显微镜机架、LED荧光光源以及宽场荧光分光镜组的倒置荧光显微镜之上。共聚焦光路包括转盘扫描单元、高灵敏度高帧率科研级相机、激光器以及激光耦合传输部件。

在共聚焦光路中,激光束通过扩束后到达标本后,标本发出的荧光被物镜捕获,沿着激发光相反的方向穿过针孔,此时针孔起到了滤除非焦平面光信号以达到光学切片的效果,随后经过过滤的光信号被二向色镜反射到科研相机的传感器上从而实现成像。

在成像过程中,有两个至关重要的光学技术保证了成像的效率和图像信噪比:

① 两枚转盘中的微透镜盘可以将激发光提前汇聚以保证穿过针孔后仍保留充足的激光发光功率。

② 高数值孔径(建议NA≥1.45)物镜保证较高的光学分辨率,以及荧光图像明亮度/信噪比。

奥林巴斯的SpinSR共聚焦超高分辨系统配合硅油系列物镜,实现更深、更亮、更高分辨的三维成像,可以观察到样品从表面到内部深处的精细显微结构。

共聚焦显微镜分类

从应用领域分类

材料科学类:针对材料科学领域,如OLS系列显微镜能够观察和分析材料的微观结构、表面形貌,为材料科学和纳米技术的发展提供有力支持。

生物医学类:如FV系列、SpinSR显微镜可以应用于生物医学研究,如细胞生物学、分子生物学、神经科学等。它们能够提供高分辨率的细胞内部结构和分子动态图像,帮助科学家揭示生命活动的奥秘。

来源：黄鼠狼论科学