摘要：2024年10月，郑州大学附属郑州市中心医院麻醉与围手术期医学科储勤军教授团队于《Drug Des Devel Ther》 (IF=4.7)杂志上发布了文章“西维来司他钠通过抑制小鼠 TLR4/Myd88/NF-κB 信号通路缓解缺血再灌注诱导的急性肾损伤”。

前 言

2024年10月，郑州大学附属郑州市中心医院麻醉与围手术期医学科储勤军教授团队于《Drug Des Devel Ther》 (IF=4.7)杂志上发布了文章“西维来司他钠通过抑制小鼠 TLR4/Myd88/NF-κB 信号通路缓解缺血再灌注诱导的急性肾损伤”。该研究的主要结论包括：

①使用西维来司他钠进行预处理可减少肾脏缺血再灌注损伤（IRI）后 NE 表达的增加，抑制肾组织IRI后中性粒细胞的聚集，保护肾脏免受IRI造成的病理损伤，使肾小管损伤评分降低，且能明显阻止 IRI 诱导的肾细胞凋亡。

②应用西维来司他钠能明显改善 IRI 后的炎症反应。使用西维来司他钠治疗可使IRI后小鼠肾脏中IL-6、TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和巨噬细胞炎症蛋白-2（MIP-2）的mRNA表达水平明显下降（均 P

③西维来司他钠可能通过控制TLR4、Myd88和NF-κB通路，从而抑制TLR4和Myd88水平，下调NF-κB pp65和NE的表达，缓解小鼠IRI AKI的病理变化。

文章摘要

目的：我们旨在检测西维来司他钠对与急性肾损伤（AKI）相关的肾缺血再灌注的影响，并探索其潜在机制。

材料与方法：将年龄在 8 至 12 周之间的小鼠随机分为四组，分别为正常生理盐水假组（C）、正常生理盐水手术组（I）、西维来司他钠（50 毫克/千克）假组（S）、西维来司他钠（50 毫克/千克）手术组（SI）（n=6，每组）。在手术组中，用非创伤性微型动脉瘤夹夹住小鼠的肾动脉，导致肾脏缺血 45 分钟。随后进行持续 24 小时的再灌注。假阴性组小鼠接受了相同的手术，但没有夹住肾蒂。小鼠眼球取血，测量血清肌酐和血尿素氮水平。再灌注 24 小时后，小鼠被安乐死，收集其肾脏进行各种分析，包括 Western Blot（WB）分析、RT-PCR、免疫荧光（IF）、苏木精和伊红（H&E）染色以及 Tunel 检测。

结果：西维来司他钠可降低肾缺血再灌注后的肾中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、血清肌酐和血尿素氮水平。西维来司他钠还能减少缺血再灌注损伤（IRI）后肾脏的组织损伤和细胞凋亡。此外，西维来司他钠还能降低IRI期间肾脏中白细胞介素6（IL-6）、巨噬细胞炎症蛋白-2（MIP-2）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和肿瘤坏死因子（TNF）-α的mRNA表达水平。与 I 组相比，SI 组肾脏组织的 TLR4、Myd88 和 NF-κB p-p65 蛋白表达水平明显降低（均 P

结论：我们证明了西维来司他钠有效缓解 AKI 引起的肾功能障碍的一种之前尚未发现的机制，可能是通过抑制 TLR4/Myd88/ NF-κB 通路。

简 介

肾缺血再灌注损伤（IRI）是引起急性肾损伤（AKI）的一种严重内科疾病，可导致快速肾功能障碍和高死亡率。这些情况包括肾移植、休克、创伤、泌尿外科和心血管外科手术等，经常出现，但缺乏适当的治疗方案。因此，探索 AKI 的机制以促进治疗方法的选择或相关药物的开发势在必行。缺血性 AKI 的发生离不开炎症反应。无论是在动物模型中还是在患有 AKI 的人类中，中性粒细胞都是缺血损伤后肾脏中最早聚集的白细胞，并且是造成肾损伤的主要因素。

中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）是一种丝氨酸蛋白酶，可加速促炎细胞因子的合成，从而加剧中性粒细胞诱发的现有炎症。NE 可影响多种物质，如细胞外基质（ECM）成分、非活性酶、参与细胞粘附的分子、负责信号传导的受体和细胞因子。

西维来司他钠是一种特异性 NE 抑制剂，目前已被批准用于治疗急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。据报道，西维来司他钠可降低 NE 或促炎细胞因子的产生，有助于改善肺功能障碍。此外，西维来司他钠还可用于癌症研究。近年来，中国也将其用于治疗 COVID-19。此外，有研究表明，西维来司他钠在多种缺血性疾病中发挥着重要作用，包括心脏IRI和脑IRI、肝脏IRI、膀胱IRI、和主动脉IRI。在这项研究工作中，我们确定了西维来司他钠对小鼠模型肾IR相关性AKI的影响，并研究了其潜在机制。

结 果

西维来司他钠预处理可降低肾IR后肾NE的表达

为了明确西维来司他钠对小鼠肾脏IRI的有效性，我们首先研究了西维来司他钠预处理对肾脏IR后NE表达的影响。我们发现，与对照组（C组）相比，肾脏IRI后（I组）弹性蛋白酶水平显著升高，而西维来司他钠治疗后（SI组）弹性蛋白酶水平显著降低（图1A和B）。

与假手术小鼠相比，在无 IRI 的情况下单独施用西维来司他钠不会影响 NE 蛋白水平。同样，肾脏切片的 IF 染色结果也显示，西维来司他钠处理后肾小管细胞中 NE 的水平显著降低，这表明西维来司他钠预处理可减少肾脏 IRI 后 NE 表达的增加（图 1C）。

图 1 肾脏中 NE 的 WB 检测结果。(A）四组（Sham+NS组、IRI+NS组、Sham+sivelestat组、IRI+sivelestat组）NE蛋白表达的WB评估结果示意图。(B）NE 蛋白表达的定量评估。*P

西维来司他钠保护肾脏免受 IRI 损伤

随后，我们研究了西维来司他钠对肾缺血后 BUN 和血清肌酐水平的影响。研究结果表明，暴露于肾脏IRI的小鼠肾功能受损，表现为BUN和血清肌酐水平显著升高（图2A和B）。病理检查显示，IRI 的肾损伤表现为肾小管扩张、肾小管内衬上皮细胞脱落、出现铸型和肾小管内衬细胞刷状边界消失（图 2C）。肾小管损伤评分用于评估肾损伤程度。使用西维来司他钠进行预处理可保护肾脏免受IRI造成的病理损伤，这表现在肾小管损伤评分减轻（图2D）。

为了进一步证明西维来司他钠具有抗细胞凋亡的作用，我们采用了 Tunel 试验来鉴定 IRI 后肾脏中的细胞凋亡（图 2E）。西维来司他钠能明显阻止 IRI 诱导的肾细胞凋亡（图 2F）。

图2 西维来司他钠预处理可保护肾脏免受IRI影响。(A）四组（假肾+NS组、IRI+NS组、假肾+西维来司他钠组、IRI+西维来司他钠组）血清CRE水平变化数据汇总。****P

西维来司他钠可减少 IRI 后的中性粒细胞浸润

考虑到中性粒细胞是肾脏IR发生时的主要防御器官，我们进一步研究了西维来司他钠治疗对中性粒细胞浸润的影响。髓过氧化物酶（MPO）是中性粒细胞活化的指标，其数量和功能反映了多形核白细胞的性能和状况。中性粒细胞过氧化物酶（MPO）是中性粒细胞活化的指标，其数量和功能反映了多形核白细胞的性能和状况。IF结果显示，肾组织IR后中性粒细胞浸润水平显著增加，而使用西维来司他钠预处理的SI组中性粒细胞聚集减少（图3）。

图 3 IRI 后肾脏中 MPO 的变化。(A）肾脏 MPO 表达的 IF 结果。4组（Sham+NS组、IRI+NS组、Sham+西维来司他钠组、IRI+西维来司他钠组）肾脏中MPO的表达。MPO用Cy5.5染成红色，肾小管上皮细胞胞质中的E-Cadherin用FITC染成绿色。细胞核用 DAPI 染成紫色。(B) MPO+cell/HFP ****p

西维来司他钠抑制 IRI 后肾脏促炎介质和趋化因子的释放

在正常情况下，肾损伤通常会刺激炎性细胞因子的转录、表达和分泌。接下来，我们研究了西维来司他钠对炎症细胞因子水平的影响。图4显示，与假手术对照组相比，IRI后小鼠肾脏中白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）-α、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和巨噬细胞炎症蛋白-2（MIP-2）的mRNA表达水平明显升高，而使用西维来司他钠治疗的IRI组则有所下降。这些结果表明，应用西维来司他钠能明显改善 IRI 后的炎症反应。

图 4 西维来司他钠对 IRI 中炎症细胞因子表达的影响。(A-D）IL-6、TNF-αmRNA、MCP-1 和 MIP-2 mRNA 的表达以点阵图显示。****p

西维来司他钠抑制了IRI后TLR4/Myd88/NF-κB通路的激活

大量研究表明，TLR4/Myd88/NF-κB 信号传导参与了炎症的调节。图 4 所示的结果表明，西维来司他钠有可能改善 IRI 后的炎症反应。在此基础上，我们研究了西维来司他钠对IRI后激活TLR4/Myd88/NF-κB信号的影响。WB分析结果显示，与C组（Sham +NS）相比，I组（IRI+NS）小鼠肾组织中的TLR4（图5B）、Myd88（图5C）和NF-κB-pp65（图5D）蛋白水平显著升高（均P

图 5 IRI 后肾脏中 TLR4、Myd88 和 NF-κB-pp65 蛋白水平的变化。(A）四组（Sham +NS组、IRI+NS组、Sham +西维来司他钠组、IRI+西维来司他钠组）TLR4、Myd88、NF-κB-pp65在WB中表达的代表性结果。(B）WB 中 TLR4 表达的定量分析。***P

讨 论

在本文中，我们发现西维来司他钠可显著减轻IRI诱导的肾损伤，这种损伤与促炎细胞因子和相关信号通路蛋白TLR4、Myd88和NF-κB的同时减少有关。这表明，TLR4/Myd88/NF-κB 信号传导的抑制可能是西维来司他钠抵御 IRI 引起的肾损伤的一种机制。

本研究使用 IRI 小鼠模型模拟 AKI。IRI模型是研究AKI的常用动物模型之一，其操作方法简单省时。IRI 模型小鼠在急性期会出现部分肾功能丧失和肾小管上皮细胞坏死，表现为 AKI。本研究采用双侧肾蒂剪切 IRI 模型，该模型常用于诱导动物缺血，因为它的病理生理条件与人类 AKI 相似，患者可能因血流受损而出现双侧肾损伤。

西维来司他钠是一种特异性 NE 抑制剂，对全身炎症反应综合征（SIRS）、急性肺水肿和通气功能障碍有理想的临床疗效。近年来，研究发现西维来司他钠对炎症细胞有抑制作用，能抑制中性粒细胞的聚集、活化和侵袭，减少炎症因子的分泌，减轻炎症反应。小鼠缺血后的肾功能在西维来司他钠的作用下得到了明显的保护，组织学损伤减轻，血清肌酐和血尿素氮水平降低，这与 T. Hayama 等人在大鼠肾脏 IR 模型中观察到的结果一致。在本研究中，肾脏 IRI 后小鼠血清肌酐和血尿素氮水平明显高于假手术组，而 SI 组的血清肌酐和血尿素氮水平明显降低，这与肾小管损伤的组织病理学 HE 染色结果一致。IRI组肾脏外观肿胀、灰暗，切面髓质分界不清；镜下主要表现为肾小管间质病变，肾小管上皮细胞明显水肿、空泡变性、基底膜萎缩、刷状缘消失、核碎裂、管间毛细血管充血等。

目前，肾损伤的临床诊断主要依靠监测尿量和肾功能指标的变化。但需要注意的是，尿量可能会受到液体补充和利尿药物的影响。尽管有研究表明，肾功能指标中的肌酐在肾损伤早期可能不会发生显著变化，而血液尿素氮水平易受非肾因素的影响，但在 IRI 动物模型中，衡量肾损伤的常用终点指标是肌酐和尿素氮水平（血清和血液）。

伴随着 AKI 的发生和发展，会产生和释放炎症因子、趋化因子、炎症细胞浸润、血管内皮细胞损伤和肾小管坏死。在本研究中，IRI 组的炎症因子和趋化因子水平明显升高，与 C 组形成鲜明对比，但 SI 组明显降低，与 I 组形成鲜明对比；中性粒细胞浸润在 IRI 组上升，在 SI 组下降，表明西维来司他钠抑制了肾 IR 后的炎症反应。Kumasaka 等人的研究表明，NE 抑制剂西维来司他钠可减轻抗 Thy1.1 肾炎大鼠的组织损伤。Voisin 等人利用 NE 敲除小鼠刺激心肌、肾脏、肠系膜和绉肌等多个器官的 I/R 损伤。在所有这些模型中，中性粒细胞向组织的浸润都受到了明显阻碍，从而同时防止了急性组织损伤。

通过我们的研究，可以看出西维来司他钠能显著减轻IRI诱导的小鼠AKI。因此，未来西维来司他钠可作为临床上有效治疗 AKI 患者的一部分，包括创伤患者因容量耗竭导致的 AKI 患者、在心肺旁路下接受心脏手术的 AKI 患者以及肾移植患者等。我们目前的研究可能存在以下局限性：1. 西维来司他钠的给药方式为静脉泵入，本研究采用单次静脉给药的方法。尽管如此，给药总量是相同的。2. 本研究没有在不同时间点设置不同的药物浓度梯度，但药物的保护作用明显可见。3. AKI 的发病机制复杂多样；多种信号通路参与了 AKI 的发生和发展，如 Ras/MAPKs/PPAR-γ；AMPK/ SENP1/Sirt3；HippoYAP/MCP-1；JAK/STAT/SOCS等。本研究仅关注经典炎症TLR4/Myd88/NF-κB通路，未观察到动物和细胞水平该信号通路蛋白的抑制现象。今后，应开展更多的基因测序和蛋白质组学等研究，探讨西维来司他钠与AKI之间的关系。

结 论

西维来司他钠能改善AKI小鼠的肾功能，减轻炎症反应和肾组织的病理损伤，抑制TLR4/Myd88/NF-κB信号传导可能是西维来司他钠保护小鼠免受IRI诱导的肾损伤的机制之一。本研究获得的启示可能为临床 AKI 患者新疗法的开发提供线索。

材料和方法

1. 动物

雄性 C57BL/6J 小鼠，年龄 8 至 12 周，体重 22 至 25 克，购自中国辽宁长生生物技术有限公司。小鼠饲养在受控环境中，确保没有致病因子存在。环境经过精心调节，温度保持在 20-22°C 之间，湿度保持在 50-60% 之间。小鼠暴露于 12 小时的光暗交替模式中，并且可以不受限制地获得食物和饮料。小鼠实验遵循《实验动物的护理和使用准则》的规定。所有实验方案均严格遵守郑州大学附属郑州中心医院动物实验伦理委员会的指导原则（伦理批号：202457）。本研究中，定量分析实验（如肾功能评估、定量实时逆转录酶 PCR）在生物学上重复六次。半定量实验也在生物学上重复了四次，每次重复都是分别独立进行的。

通过腹腔注射艾司卡胺（50 毫克/千克）和咪达唑仑（40 毫克/千克）进行麻醉。通过在肾蒂上使用非创伤性微型动脉瘤夹对这些肾脏进行缺血。在 45 分钟的缺血期间取消夹子。在手术过程中，使用热垫将小鼠保持在温暖的温度下。假组小鼠的手术技术完全相同，只是没有夹住肾蒂。从小鼠眼球取血，定量检测血清肌酐和血尿素氮水平。再灌注 24 小时后，小鼠被安乐死，取肾进行 Western Blot (WB)、RT-PCR、免疫荧光 (IF)、Hematoxylin and Eosin (H&E) 染色和 Tunel 分析。

3. 研究分组

小鼠随机分为以下 4 组（n=6/组）：

i. C 组：假手术组，注射 0.9% 氯化钠生理盐水（Sham+NS）；

ii. I 组：小鼠进行 IRI 手术，并注射 0.9% 氯化钠 NS（IRI+NS）；

iii. S 组：假手术组，给予西维来司他钠（Sham+sivelestat）；

iv. SI组：小鼠接受IRI手术并注射西维来司他钠（IRI+sivelestat）；

麻醉后，通过眶后静脉给各组小鼠注射 0.9% 氯化钠或 50 毫克/千克西维来司他钠（约 0.1 毫升）。

4. 肾功能评估

血清肌酐测定采用易得肌酐检测试剂盒（Cat No.C011-2-1，南京建成生物工程研究所），血尿素氮（BUN）水平定量（Cat No.BC1535，Solarbio，中国）（n=6/组）。

5. 细胞凋亡检测

采用细胞凋亡检测试剂盒（订货号：MK1025，Booster Biological Technology, Ltd. China）检测细胞凋亡。凋亡细胞的存在通过末端转移酶 dUTP 缺口标记法（TUNEL）进行评估。在观察者不知道样本身份的情况下，测量每个样本随机选择的五个高倍视野（HPF）中 TUNEL 阳性细胞的数量（n=4/组）。

6. WB 分析

使用蛋白酶抑制剂混合物与 RIPA 缓冲液分离蛋白质。蛋白质含量用 Bio-Rad 蛋白质分析仪测定。通常用 40 毫克蛋白质装入带有 Tris/SDS 缓冲溶液的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶。在随后的步骤中，凝胶中的蛋白质被置于硝酸纤维素膜上。阻断阶段结束后，在环境温度下将膜与一抗孵育过夜。冲洗后，用二抗对膜进行孵育。使用 WB 成像仪（Amersham™ ImageQuant™ 800 生物分子成像仪，美国马萨诸塞州）测定蛋白质。利用 NIH Image/J 程序（美国马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院）确定蛋白质表达量（n=4/组）。

7. H&E 染色

用甲醛固定的肾组织被嵌入石蜡中，然后切成 5 µm 厚的切片。随后用二甲苯处理这些切片以去除石蜡，并用乙醇逐渐复水。由不了解该组情况的病理学家对这些切片进行形态学染色。肾小管损伤评分基于肾小管损伤的百分比，无损伤，0分；1-25%损伤，1分；25-50%损伤，2分；50-75%损伤，3分；75-100%损伤，4分（n=4/组）。

8. IF 检测

对石蜡包埋的肾切片进行 IF 检测。组织切片脱水脱蜡后进行抗原检索。抗原回收液（0.01 M柠檬酸钠，Ph.6.0，Solarbio，中国生命科学研究院）。用 3% H2O2 阻断内源性过氧化物酶活性，用 0.5% 100×Triton 破坏细胞膜，然后用 5% 驴血清孵育阻断物，并用一抗在加湿室中孵育载玻片过夜。洗涤后，用荧光二抗孵育肾脏切片；进一步洗涤后用 DAPI 染色细胞核（n=4/组）。

9. 定量实时逆转录酶 PCR

用 TRIzol 试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）提取肾组织的总 RNA。然后，使用 NovoScriptPlus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）（苏州诺维信生物科技有限公司）反转录 1 µg mRNA。使用 BioRad 实时 PCR 仪和 Novoprotein 公司生产的 NovoStartSYBR qPCR SuperMix Plus 试剂盒进行实时 PCR 分析。目标基因表达量的测量采用比较 Ct 技术（ΔΔCt）计算，相对测量值为 2-ΔΔCt。比较各组目标基因与看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的比率。目标基因的引物序列如表 1 所示。（n=6/组）。

10. 统计分析

所有数据均以均数 ± SD 表示。采用方差分析对各组进行比较，然后采用 Bonferroni 方法对均值进行比较。采用 Wilcoxon 秩和检验来检验肾小管损伤的评分。P

参考文献：

Wang J, Wu Y, Mao M, Bing H, Sun L, Xu W, Tian W, Xia Z, Jin X, Chu Q. Sivelestat Sodium Alleviates Ischemia-Reperfusion-Induced Acute Kidney Injury via Suppressing TLR4/Myd88/NF-κB Signaling Pathway in Mice. Drug Des Devel Ther. 2024 Oct 5;18:4449-4458. doi: 10.2147/DDDT.S480148. PMID: 39399126; PMCID: PMC11466837.

来源：橙子同学