摘要：CCS Chemistry是由中国化学会创办的高水平旗舰新刊，面向全球科学家，收录化学各领域高质量原创科技论文。关注CCS Chemistry，即时获取期刊相关资讯。

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CCS Chemistry是由中国化学会创办的高水平旗舰新刊，面向全球科学家，收录化学各领域高质量原创科技论文。关注CCS Chemistry，即时获取期刊相关资讯。

近日，中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室汪海林研究组在纳米去甲基化酶催化5-甲基化胞嘧啶（5mC）氧化研究方面取得重要进展，该团队首次发现光激活的碳化氮g-C3N4能够高效催化DNA上的5-甲基化胞嘧啶去甲基化形成5-醛基胞嘧啶（5fC）。通过批量筛选光催化材料，确定单银原子掺杂g-C3N4（Ag/g-C3N4）可以提高光催化氧化（5fC产率：~92%）。通过多种表征实验确定反应机理：光激活的g-C3N4和Ag/g-C3N4的光活化会产生光生空穴，光生空穴从5mC的甲基中提取氢原子形成5mC·自由基，其与分子氧反应形成5mC-OO·自由基，再与电子和H+结合形成5mC-OOH，最终脱水生成5fC。基于此，本文进一步提出了一种DNA上5mC的单碱基测序方法，识别准确率达89.5%。该方法未来可替代传统的基于重亚硫酸盐的测序法用于单细胞DNA中的5mC测序，具有良好的应用前景。

图1. 光激活Ag/g-C3N4选择性催化5-甲基化胞嘧啶氧化形成5-醛基胞嘧啶过程示意图

背景介绍：

5-甲基胞嘧啶（5mC）是人基因组DNA上一种重要的表观遗传修饰，它在TET蛋白的催化作用下可发生DNA去甲基化过程，主要形成5-羟甲基胞嘧啶，并伴随少量5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶的生成。该过程在生殖、发育、疾病和治疗中起着关键作用。液相色谱-质谱等技术能够对这些修饰胞嘧啶进行定量研究，但无法确定其位点，因而无法深入探究其生物学功能。5mC的C-C键化学性质稳定，难以直接氧化。V2O5和K2OsO4能够将5mC氧化，但这种方法只能氧化嘧啶环上的双键，方法应用价值有限。KRuO4能够选择性氧化5-羟甲基胞嘧啶上嘧啶环外的羟甲基，被广泛应用于5mC测序，如何能找到一种氧化5-甲基胞嘧啶上嘧啶环外甲基的方法目前仍是一个重大的技术挑战。

本文亮点：

半导体催化剂能在光照下产生具有强氧化性的羟基自由基和光生空穴，TiO2和g-C3N4等常用于将甲苯上环外CH3氧化成CHO从而形成苯甲醛。基于此，中国科学院生态环境研究中心环境化学与环境毒理全国重点实验室汪海林团队马杨德博士通过试验大量的光催化材料，发现一些光催化材料可氧化5mC，但这些材料的反应选择性各有差别，其中g-C3N4能够将DNA上的5-甲基胞嘧啶选择性地氧化成5-醛基胞嘧啶（5fC），产率为86.3%，表明其具有专一性高的去甲基化的纳米酶功能。

图2. 催化剂筛选。（A）DNA上的5mC氧化成5fC反应式；（B）UHPLC-Q-TOF-MS监测5mC脱氧核苷氧化反应；（C）UHPLC‒MS/MS分析5mC-DNA探针氧化反应；（D）5mC-DNA探针氧化反应中的5mC转化率和5fC产率。

研究团队还发现掺杂不同的单原子能够提高催化剂的反应选择性，其中单原子Ag掺杂效果最佳，5mC转化为5fC的产率可达92.5%。自由基猝灭实验表面，光生空穴在氧化5mC过程中占主导作用，同时g-C3N4表面丰富的电荷能够更好地吸附DNA，增加反应接触面积。同位素标记实验确定了生成的5-醛基胞嘧啶醛基上的O主要来自于O2，少量来自于H2O中O。通过DMPO标记，利用高效液相色谱-质谱联用技术发现反应过程中可产生5mC·自由基和反应中间产物5mC-OOH。在此基础上，作者提出了一种反应机理：光生空穴从5mC的甲基中提取氢原子形成5mC·自由基，其与分子氧反应形成5mC-OO·自由基，再与电子和H+结合形成5mC-OOH，最终经过脱水生成5fC。

图3. 单原子负载对g-C3N4催化效果的影响。（A）5mC-DNA探针氧化反应中的5fC产率；（B）碘化钾对5mC脱氧核苷氧化反应的影响；（C）结合同位素标记和UHPLC‒MS/MS确定生产的5fC醛基上的O来源；（D）UHPLC‒MS/MS检测被DMPO标记的5mC·自由基。

本文进一步利用该纳米酶用于5mC探针氧化，再结合CLEVER-seq测序方法，实现了5mC位点的测序，5mC识别准确率为89.5%。该纳米酶的发现具有良好的应用前景，未来可替代传统的基于重亚硫酸盐的5mC测序法用于单细胞的5mC测序。

图4. 基于纳米酶Ag/g-C3N4的5mC测序方法。（A）反应不同时间后，5mC-DNA探针上的5mC在测序中被识别成T；（B）5mC-to-T的转化率。

总结与展望：

综上所述，本文报道了光激活的g-C3N4可以作为纳米去甲基化酶用于高选择性氧化5mC形成5fC，单原子Ag掺杂能够进一步促进该反应。与生物去甲基化酶（TET1-3）相比，该纳米酶具有更好的选择性。文章进一步结合同位素标记、DMPO标记自由基和UHPLC-MS/MS分析等手段详细探究了该反应过程，提出了反应机理。结合该纳米去甲基化酶和CLEVER-seq测序，实现了DNA上的5mC单碱基测序，展示了一种新的不依赖重亚硫酸盐的5mC测序方法。该纳米酶的发现具有良好的应用前景，未来可用于单细胞中的5mC测序。

相关研究发表在CCS Chemistry，中国科学院生态环境研究中心马杨德和汪惠东为共同第一作者，汪海林研究员为通讯作者。

文章详情：

Photoactivatable nano-demethylases for selective oxidation of the epigenetic mark DNA 5-methylcytosine to 5-formylcytosine

Yangde Ma†, Huidong Wang†, Rui Zhang, Ruibin Li, Hongquan Zhang, Xiangjun Li and Hailin Wang*

Cite This by DOI: 10.31635/ccschem.025.202405046

文章链接：https://doi.org/10.31635/ccschem.025.202405046

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来源：澎湃新闻客户端