摘要：从鼻中隔分离出原代成年大鼠鼻软骨细胞，在单层培养中扩增细胞数量，并在软骨培养基中的聚乙醇酸支架上体外培养细胞，培养期为 5-10 周。通过确定参与肥大性软骨形成的关键标记基因和蛋白质的时间表达来评估肥大性分化。测量的基因的时间变化反映了生长板中观察到的时间变化
大型骨缺损的再生在临床上仍然具有挑战性。我们的研究目的是使用大鼠模型，利用鼻软骨细胞设计出一种肥大性软骨组织，该组织可通过软骨内骨化在体内重塑为骨骼。从鼻中隔分离出原代成年大鼠鼻软骨细胞，在单层培养中扩增细胞数量，并在软骨培养基中的聚乙醇酸支架上体外培养细胞，培养期为 5-10 周。通过确定参与肥大性软骨形成的关键标记基因和蛋白质的时间表达来评估肥大性分化。测量的基因的时间变化反映了生长板中观察到的时间变化。胶原蛋白 II 基因表达在第 7 天增加了 6 倍，然后从第 14 天开始显着下调。相反，胶原蛋白 X 基因表达在第 14 天即可检测到，到第 35 天增加了 100 倍。胶原蛋白 X 表达的暂时增加反映在碱性磷酸酶基因表达的增加上，碱性磷酸酶基因表达在第 14 天也可检测到，到第 35 天基因表达增加了 30 倍。工程化结构的组织学和免疫组织化学分析显示软骨细胞体积增加（31-45 µm），胶原蛋白 X 在细胞外基质中沉积，碱性磷酸酶活性表达。然而，在长达 10 周的体外培养中未观察到软骨矿化。在皮下植入肥大工程化结构时，移植物变得血管化，发生软骨矿化，并观察到基质中蛋白多糖的损失。将肥大的工程构建体植入大鼠颅骨缺损中，导致血管生成、矿化以及软骨组织重塑为骨。微 CT 分析表明，接受工程化肥大结构的缺损部位骨体积为 38.48%，而对照缺损部位的骨体积为 7.01%。开发组织工程化肥大软骨作为骨移植替代品是再生医学领域令人兴奋的发展。这是一项主要研究的证明，证明了鼻软骨细胞具有工程化肥大软骨的潜力，该软骨将在体内移植后重塑为骨骼。这种制造工程化肥大软骨移植物的方法可以成为未来颌面重建新临床治疗的基础。 一、简介 骨是继血液之后第二大移植组织。尽管如此，无论是先天性还是由创伤或疾病引起的大型骨缺损的修复在临床上仍然具有挑战性。至关重要的是，移植到骨缺损中的骨组织能否存活取决于组织是否获得足够的血液供应以提供必需的氧气和营养物质并清除废物。目前，自体骨是骨组织移植的临床“黄金标准”。自体骨是一种具有骨传导和骨诱导特性的活组织，不会被患者的免疫系统排斥。然而，使用自体骨组织也存在一些缺点，包括供体部位术后持续疼痛和供体部位发病率。从患者身上提取的健康组织数量也有限，不会造成剩余骨骼结构不稳定，这个问题在儿童中尤为突出。骨同种异体移植和异种移植用于骨修复，但必须脱细胞以降低其免疫原性，因此，它们具有骨传导性，但骨诱导能力较弱。同样，迄今为止，现有的生物材料骨移植替代品具有良好的骨传导特性，但其骨诱导特性有限。因此，临床上迫切需要开发新的骨移植材料来修复和再生骨缺损。组织工程和再生医学技术是生成骨移植替代品以满足这一需求的有前途的“工具”。大多数组织工程方法集中于通过膜内骨化途径产生骨组织，其中间充质干细胞直接分化为成骨细胞，从而直接产生骨样细胞外基质。通过这种方式进行骨组织工程的主要挑战之一是提供足够的营养和氧气，这对成骨细胞的生存至关重要。在培养大型三维组织结构的过程中，有限的扩散会导致细胞增殖、分化和细胞存活的问题。克服这些限制的方法包括使用生物反应器提供动态培养条件，并通过包括具有分化信号的内皮细胞来刺激毛细血管的形成来设计预血管化移植物。发育组织工程模仿体内组织形成的自然途径，是生产用于移植的移植组织的潜在途径。软骨内骨化负责胚胎发生过程中轴向骨骼和长骨的形成，是一种潜在的、目前尚未被探索的产生合适的替代骨修复移植物材料的途径。软骨内骨化涉及肥大性软骨模板的形成，该模板经历矿化、血管侵入，随后重塑为骨骼。在活跃生长期间，幼儿和青少年的生长板中可以看到肥大性软骨的形成及其通过软骨内骨化重塑为骨骼，在成人骨折愈合期间，‘软’软骨骨痂经历骨化变成编织骨。在生长板中，增殖的柱状软骨细胞产生复杂的透明软骨细胞外基质 (ECM)，其中主要蛋白质是 II 型胶原蛋白。这些软骨细胞随后经历终末分化，成为肥大性软骨细胞表型，并在 ECM 中产生对矿化至关重要的 X 型胶原蛋白。与研究更广泛的膜内骨化形成的骨组织结构相比，软骨结构具有多种优势。软骨比含有成骨细胞和间充质干细胞的骨组织能承受更低的氧浓度。软骨的这一优势既可以培养更大的移植物，也可以使软骨移植物在植入受伤部位后存活得更好。肥大性软骨还含有促进组织内基质重塑、血管生成和骨形成所需的生物因子。因此，一旦植入体内，肥大性软骨就会募集血管并通过正常的生理过程软骨内骨化重塑为骨组织。因此，利用组织工程肥厚软骨的潜力值得进一步研究。人们普遍对在再生医学和组织工程中使用间充质干细胞来修复/再生体内的透明软骨缺损感兴趣；例如关节软骨的再生和头颈部软骨缺损，例如鼻中隔。相比之下，很少有研究专注于工程肥大性软骨。研究人员证明，骨髓间充质干细胞 (BM-MSCs) 在颗粒培养中能够分化为肥大样软骨细胞，这些细胞表达 X 型胶原蛋白和碱性磷酸酶，并在皮下植入时矿化。研究人员还报告说，将 BM-MSCs 接种在成型胶原支架上，然后进行软骨发生引发，在皮下植入时会形成矿化的骨小梁。研究人员最近还报告说，封装在成型水凝胶结构中的 BM-MSCs 在体外软骨发生引发和 8 周的皮下植入后，在构建体的周围形成了一层矿化组织。虽然间充质干细胞已被批准用于临床，但其他成体细胞可能为肥大性软骨的生产提供有利来源。研究表明，与成人软骨细胞相比，间充质干细胞产生的软骨具有较低水平的 ECM 和较低的机械强度。然而，研究表明，原代成人透明软骨细胞在体外培养时会在 ECM 中产生高水平的 GAG，从而产生透明软骨。在使用软骨细胞形成肥大性软骨方面，先前的研究表明，永生化成人关节软骨细胞在颗粒培养中变得肥大并矿化。此外，据报道，源自人类胚胎股骨的永生化软骨细胞在培养基中产生骨诱导信号。然而，将转基因细胞用于临床应用存在重大的监管和安全问题。两种成人软骨细胞来源，鼻中隔和肋软骨，有可能成为成人透明软骨细胞的来源，这些软骨细胞可以进行终末分化，形成肥大性表型。这两种组织都有能力在体内进行软骨内骨化；例如，鼻软骨附着在面骨上。此外，这两种组织都可以在临床上通过活组织检查来采集。鼻中隔可能是一种更简单的活检程序，供体部位发病风险较低。此外，从鼻中隔中提取的软骨细胞因其产生透明软骨基质的能力而在组织工程中得到了广泛的研究，并已在临床上用于修复鼻中隔缺损。迄今为止，只有一项详细的体内研究考虑将鼻软骨细胞用于组织工程，作为骨再生的肥大性软骨模板。在这里，工程化结构在皮下植入后不会矿化，但在成骨预培养和植入陶瓷支架后能够进行一定程度的矿化。最近，研究人员描述了一群具有祖细胞特征的鼻中隔软骨细胞。本研究的总体目的是研究从鼻中隔（一种潜在的临床相关细胞来源）分离的软骨细胞是否可以产生肥大的软骨组织，该软骨组织在移植到体内骨缺损时会重塑成骨。我们的第一个目标是使用大鼠模型分离和培养鼻软骨细胞，并研究软骨细胞是否会在聚左旋乙醇酸 (PGA) 支架的 3D 培养中产生肥大性软骨基质。还从肋骨中分离出软骨细胞并以相同的方式培养作为对照。第二个目标是将工程化肥大性软骨皮下植入体内，以研究植入物的生物相容性和血管生成。还将工程化肥大性软骨植入大鼠颅骨的体内骨缺损中，以确定软骨是否会重塑为骨骼。二、材料和方法2.1 细胞分离和扩增在安乐死后 2 小时内从 6 周大的 Wistar 大鼠身上采集鼻软骨和肋软骨，并按照我们之前描述的方法分离和培养软骨细胞，这种方法与其他研究人员报告的细胞分离和扩增方法类似。简而言之，取出软骨，在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中清洗，然后用手术刀片刮擦软骨表面以去除任何上皮组织。再次用 PBS 清洗软骨，切成小块，在 2.5% 胰蛋白酶中孵育 30 分钟，然后在基础培养基 [杜尔贝科改良的 Eagle 培养基 (DMEM)，补充非必需氨基酸 (NEAA) 、100 单位.ml^(-1) 青霉素和 100 ug.ml^(-1) 链霉素 ，以及 10 mM HEPES 缓冲液和 10% 胎牛血清 ] 中在 3 mg.ml^(-1) 细菌胶原酶 中消化过夜。将消化后的组织通过 70 µm 细胞过滤器，然后离心 (10 分钟，192g) 使细胞沉淀，从消化后的组织中分离出软骨细胞。将细胞悬浮在 PBS 中并重复离心步骤，以清洗细胞沉淀。重复此清洗步骤一次，并将最终细胞沉淀悬浮在含有 10 ng.ml^(-1) 成纤维细胞生长因子-2 的基本培养基中。将细胞接种到培养瓶中，并在 37℃、5% CO2 和 95% 空气的湿润气氛下培养箱中培养。每周更换两次培养基（含有 10 ng.ml^(-1) FGF-2 的基本培养基）。2.2 支架使用商用 PGA 支架。Biofelt 支架是一种可生物降解的 1 毫米厚的非编织 PGA 毡，体积密度为 70mg.cc^(-1)，由医用级聚合物制成。为了进行实验，使用软木钻从支架板上切下直径为 5 毫米的圆盘，并用异丙醇覆盖圆盘 15 分钟以对其进行消毒，这是制造商推荐的方法。去除异丙醇，并用无菌 PBS 彻底清洗圆盘，以确保去除异丙醇。然后将支架圆盘在基础培养基中再处理 20 分钟。这种支架已被广泛报道，主要作为新型生物材料研究中的参考材料。
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图 1：胸骨（a）或鼻软骨细胞（b）构建体组织切片的代表性组织学和免疫组织化学染色，这些组织切片接种在 PGA 支架上并培养42 天。图像上方的图例显示了所使用的染色程序。图像显示了通过苏木精和伊红 (H&E) 进行的组织化学染色，以显示一般组织形态、蛋白聚糖的分布（通过阿尔新蓝染色显示，蛋白聚糖染成蓝色）、胶原蛋白 II 和胶原蛋白 X 的定位（胶原蛋白定位通过棕色染色显示）和碱性磷酸酶活性的组织化学染色（ALP，酶活性通过黑色/棕色染色显示）。免疫组织化学图像中插入了显示非特异性抗体染色的对照切片。比例尺 = 200 µm。在 42 天的培养期内，鼻软骨细胞结构内观察到了显著的形态和表型变化（图 2a）。在接种结构后和培养初期，鼻软骨细胞表现出与透明软骨细胞表型（8-12 µm，第 14 天）相当的细胞大小和形态。培养第 28 天时，在孤立的结构口袋中观察到细胞大小增加（31-45 µm）的软骨细胞，这表明其具有肥大性表型。培养第 42 天时，结构显示出肥大性软骨细胞的均匀分布。关于细胞外基质 (ECM) 的形成，到第 14 天时，在构建体中观察到少量沉积（就胶原蛋白 II 和蛋白聚糖而言）。然而，随着培养时间的延长，ECM 沉积增加，如第 28 天和第 42 天组织形态的增加以及构建体中蛋白聚糖的定位和沉积增加所示，如构建体中 GAG（蛋白聚糖的量度）的定量测定所示（图 2b）。在整个培养期间，ECM 内主要软骨蛋白的表达也发生了改变，表明存在肥大性分化。到第 14 天时，构建体显示出胶原蛋白 II 型的表达，而未检测到胶原蛋白 X 型的表达。到第 28 天，在显示肥大性软骨细胞的区域中检测到胶原蛋白 X。然而，此时观察到的碱性磷酸酶活性很少。到第 42 天，观察到胶原蛋白 X 和碱性磷酸酶的定位，同时大多数细胞呈现肥大形态（图 2a）。在第 42 天评估了构建体的矿化程度，虽然构建体在碱性磷酸酶和胶原蛋白 X 蛋白沉积方面表现出肥大分化，但在体外培养期间未检测到矿化。
图 2：(a)。在 PGA 支架上接种并培养 14、28 和 42 天的鼻软骨细胞组织切片的代表性组织学和免疫组织化学染色。图像显示胶原蛋白 II 和 X 的免疫定位以及碱性磷酸酶活性。从第 14 天开始可检测到胶原蛋白 II。到第 28 天，软骨细胞表现出细胞尺寸增加，检测到胶原蛋白 X，到第 42 天胶原蛋白 X 广泛分布。碱性磷酸酶活性在第 28 天和第 42 天也可检测到。在孵育 42 天后使用茜素红研究钙沉积；然而，没有观察到钙沉积。(b)。显示体外培养期间鼻软骨细胞结构中的糖胺聚糖 (GAG) 积累（表示为组织干重的百分比）。在 42 天的培养期内，构建体中的 GAG 量增加，表明在整个培养期内细胞外基质沉积增加。（n=6，误差绘制为均值的标准误差，* p3.2 3D 培养对软骨细胞基因表达的影响从天然软骨分离后，鼻软骨细胞在二维 (2D) 单层培养中生长以扩大细胞数量。在基础培养基中将软骨细胞在 PGA 支架上培养 72 小时后，与 2D 单层培养相比，基因表达发生了明显变化（补充数据，图 2）。观察到 Ihh、Sox9 和 II 型胶原蛋白的表达显著增加，表明软骨细胞正在恢复到更透明的表型。相反，在 PGA 支架的 3D 环境中培养软骨细胞的前 72 小时内，肥大分化的标志物 X 型胶原蛋白、碱性磷酸酶和 Runx2 显著减少。3.3 分化对软骨细胞基因表达的影响在支架接种期后的 42 天培养期内，软骨结构内的基因表达发生了显著变化（图 3）。ECM 成分胶原蛋白 II（透明软骨细胞表型的标志物）在最初的 72 小时细胞接种期后持续增加，直到第 7 天，基因表达增加了 6 倍。第 7 天后，II 型胶原蛋白的基因表达在整个培养期间的剩余时间内显着下调（图 3a）。相反，X 型胶原蛋白的基因表达从第 7 天到第 14 天增加，第 21 天表达出现可重复的下降，随后表达增加，在第 35 天达到峰值，增加了 100 倍（图 3b）。类似地，碱性磷酸酶的基因表达从第 7 天增加到第 35 天的峰值水平（图 3c）。信号蛋白 Indian hedgehog (IHH)（一种前肥大标志物）的基因表达从第 14 天开始上升，在第 21 天达到显著的峰值（增加了 30 倍），然后下降到较低水平（6 倍）（图 3d）。转录因子 Sox9 的基因表达在第 3 天到第 35 天显著降低，此时表达增加，与 X 型胶原蛋白和碱性磷酸酶基因表达的峰值时间相对应（图 3e）。转录因子 Runx2 的表达在培养期的第 14 天增加，并在第 28 天达到基因表达的峰值。Runx2 的基因表达随后在第 35 天下降至约 3 倍（图 3f）。
图 3：肥大分化过程中与软骨内骨化相关的基因的 mRNA 表达。数据被标准化为在支架细胞接种 72 小时后观察到的基因表达。（a）II 型胶原蛋白（Col 2g1 链）；（b）X 型胶原蛋白（Col Xg1 链）；（c）碱性磷酸酶；（d）印度刺猬蛋白 (IHH)；（e）SRY（性别决定区 Y）-box 9 (SOX9) 和 (f) runt 相关转录因子 2 (Runx2)。（* p3.4 体内修复3.4.1 皮下植入由于肥大结构未能在体外矿化；对肥大结构进行了皮下植入，以确定结构是否会在体内进行矿化。在植入之前，构建体显示出肥大的软骨组织的特征（通过肥大细胞区域显示）；某些区域的 X 胶原蛋白沉积在 ECM 和碱性磷酸酶活性（参见补充图 3）。回收结构的组织学分析显示，它们被一层薄薄的纤维结缔组织包裹。免疫定位研究使用抗 CD45+ 检测白细胞和抗 CD68+ 抗体检测巨噬细胞，表明回收结构的外部区域周围存在一些炎症细胞，但它们的定位很稀疏，主要局限于非软骨区域（补充图 4）。未检测到巨细胞。植入 4 周后，植入物表面和内部均有大量血管（图 4b、g）。在软骨结构周围结缔组织附近区域和血管侵入区域周围观察到组织重塑（图 4g），在用 Alcian Blue 和 Eosin 染色的切片上可以清楚地看到软骨基质重塑，单个软骨细胞仍嵌入薄薄的 GAG 层中，被新形成的非软骨基质包围（图 4g）。植入 4 周后，X 胶原蛋白分布于结构的整个软骨区域（图 4a、b）。此外，在植入的结构中检测到碱性磷酸酶（图 4c、d）。与体外实验相反，植入 4 周后，在所有样品中都观察到钙沉积（图 4e、f），在软骨细胞周围的软骨区域发现矿化基质，并且它很大程度上与高碱性磷酸酶活性区域共定位。然而，从组织学角度来看，矿化似乎是由于矿化软骨造成的，因为在这些实验中没有观察到明显的骨形成。
图 4：皮下植入 4 周后回收构造的代表性组织学和免疫化学切片。图像显示了胶原蛋白 X（a、b）、碱性磷酸酶（c、d）、茜素红染色图像 e 至 g 中的钙沉积的分布，以及血管侵入区域的糖胺聚糖染色减少（阿尔新蓝/伊红染色切片，h）。比例尺 = 500 µm (a、c、e) 100 µm (b、d、f、h) 和 50 µm (g)。相反，在体外培养 4 周后，未观察到结构中的矿化现象 (补充图 5)，尽管在延长的培养期内观察到大量胶原蛋白 X 沉积和碱性磷酸酶活性。3.4.2 颅骨植入分化 35 天后的植入前结构在细胞尺寸大、胶原蛋白 X 和碱性磷酸酶表达方面表现出肥大表型 (补充图 6)。在没有细胞和一些 ECM 形成的情况下，PGA 溶解速度非常快，释放酸性降解产物，有可能在靠近大脑表面的相对狭窄区域引起炎症反应。因此，无细胞 PGA 支架无法植入空缺损处。在所有检查时间点，植入组织工程肥大软骨移植物均促进了骨矿化形成（图 5a、5b、5c）。4 周后，肥大移植物在缺损处矿化率为 15.15%，而未治疗缺损处矿化率为 7.06%。组织学分析表明，移植物内开始血管化，并且侵入血管周围的 GAG 在 4 周内减少。8 周时，与未治疗缺损相比，治疗缺损的骨体积百分比显著增加（分别为 22.94% 和 7.07%）（图 5b 和 5d）。组织学分析时，缺损内形成的骨样组织的形态外观也支持了这一点（图 6 a、b）。到第 12 周，微 CT 数据显示，与未治疗的缺损（7.56%）相比，缺损的矿化率为 38.48%（图 5c、d），并且组织学上还观察到肥大性软骨进一步重塑为骨。在颅骨缺损中观察到少量骨形成，这些缺损仍是空的（即它们没有接受肥大性软骨构造）。在这些缺损中形成了纤维组织来桥接缺损（补充图 7）。
图 5：缺损的微 CT 分析。（a – c）微 CT 图像显示 4 毫米颅骨缺损内的矿化情况，缺损处要么空置，没有植入任何移植材料，要么在植入期（a）4 周、（b）8 周和（c）12 周后用肥大性软骨移植物治疗。图 5d 显示了整个愈合期内通过微 CT 确定的缺损内骨长入量。（* p
图 6：在体内植入 8 周后用肥大性软骨移植物治疗的颅骨缺损脱钙切片的苏木精和伊红染色代表性图像。图像显示血管浸润以及血管浸润区域周围骨样组织的形成。总放大倍数：图像 (a) x40，图像 (b) x200。四、讨论这是一项使用大鼠模型的概念验证研究，该研究展示了使用鼻软骨细胞在体外产生组织工程肥大结构。这项研究表明，这种工程肥大软骨材料具有骨化能力，并能增强体内骨缺损中的骨再生。选择无纺布 PGA 作为支架材料，因为这些聚酯已在组织工程方面得到充分研究，并且已获得美国食品和药物管理局的临床使用批准。PGA 的缺点是在降解过程中会释放乙醇酸副产物，据报道会引起附近组织的炎症和坏死。使用 PGA 支架可实现良好的细胞附着、增殖和肥大分化。在皮下植入肥大结构时，在结构周围观察到轻微的炎症反应，表现为巨噬细胞 (CD 45+ 细胞) 和淋巴细胞 (CD68+ 细胞) 的免疫定位。将肥大结构植入颅骨缺损模型时未观察到明显的炎症。本研究中产生的组织工程肥大软骨具有与生长板中相似的特征。工程组织表现出较大的细胞形态，并在细胞外基质中表达经典的肥大软骨标志物，即 X 型胶原蛋白和碱性磷酸酶。鼻软骨细胞/PGA 结构在体外培养期间的 Sox9、胶原蛋白 II 和 X、Runx2 和碱性磷酸酶的基因表达时间也反映了生长板内软骨细胞肥大期间的基因表达。众所周知，软骨细胞在 2D 培养条件下会去分化，而 2D 培养条件可用于扩大细胞数量以接种到支架上。在 3D 培养过程中，胶原蛋白 II 的基因表达在第 7 天升高，表明软骨细胞恢复了透明软骨表型。到第 14 天，胶原蛋白 II 基因表达显著下调，胶原蛋白 X 表达增加，碱性磷酸酶基因表达从培养第 7 天开始，在第 35 天达到峰值。在整个分化期间，还监测了信号分子 IHH 和转录因子 Sox9 和 Runx2 的时间基因表达，发现它们反映了生长板中软骨细胞肥大的情况。在生长板中，IHH 表达定位于有丝分裂后、肥大前软骨细胞区域，该区域毗邻增殖的柱状细胞并调节软骨细胞的肥大分化。据报道，IHH 通过两种机制发挥作用，通过 PTHrP 途径和 Ptc-1 受体抑制肥大分化，或通过 Wnt/BMP 途径促进肥大分化。在第 21 天观察到 IHH 基因表达的峰值，就在 Runx2 表达的峰值之前。Runx2 在肥大性分化过程中必不可少，因为它可以调节与矿化和血管生成相关的其他基因的表达，包括 BMP 和 VEGF，以诱导软骨中的血管生成。Runx2 还通过合成基质金属蛋白酶 (MMP) 和骨桥蛋白来促进细胞外基质重塑，从而使破骨细胞能够附着。这些下游蛋白质对于组织工程肥大性软骨内随后的矿化和骨形成至关重要。Sox9 被认为通过 PTHrP 通路发挥作用，以维持细胞处于增殖状态。然而，研究人员表明，Sox9 也是肥大分化的重要转录因子，它位于软骨细胞的细胞核，独立地或通过与 mef2c 合作作用于 X 型胶原蛋白启动子。我们观察到整个培养期间 Sox9 的下调，第 35 天 Sox9 表达增加，这与构建体中 X 型胶原蛋白的峰值表达相对应。这种能够创建具有天然肥大性软骨形态和表型特征的工程组织的能力对于体内矿化和骨重塑至关重要。虽然在 PGA 支架材料上成功体外生产具有肥大性软骨特征的工程组织，但这些结构未能在体外显示软骨矿化。然而，这些结构在体内植入时确实经历了软骨矿化（图 4），但在体外长期培养时没有。肥大性软骨的矿化是后期骨化的先决条件。关于软骨矿化为何未在体外发生，有几种假设。要么使用的培养条件不利于肥大性软骨细胞进行软骨矿化，要么需要另一种细胞类型（例如内皮细胞或成骨细胞祖细胞）的相互作用才能启动软骨矿化阶段。在体内皮下植入时，组织结构的血管化发生在随后的矿化和骨形成之前。表达 CD34+ 的内皮祖细胞和造血干细胞先前已被证明对骨折的新生血管形成和随后的骨折愈合很重要。研究人员观察到 CD34+ 细胞具有产生成骨细胞的能力，这些细胞可以表达成骨标志物、骨钙素和碱性磷酸酶。在移植物血管化周围观察到的 ECM 减少可归因于肥大性软骨的血管化。MMP 已被证明在血管形成区域及其周围表达，包括 MMP-9（明胶酶 B），它已被证明可以降解肥大软骨 ECM 内的胶原蛋白。这种组织结构初始血管化的需要凸显了在移植物内表达血管生成因子（如 VEGF）以招募 CD34+ 细胞的重要性。植入颅骨缺损后，鼻软骨细胞/PGA 结构被血管侵入，软骨被重塑为骨样组织。虽然所用的骨缺损大小在有足够的时间的情况下能够自我修复；但含有鼻软骨细胞/PGA 结构的骨缺损显示出明显更多的骨再生。因此，在体内植入后在肥大性软骨移植物内观察到的骨再生可能是对血管侵入组织和肥大性软骨基质降解的下游反应，因为血管化允许成骨细胞和单核细胞衍生的破骨细胞流入以调节骨形成。五、结论目前研究使用增生软骨作为生产骨移植替代品的潜在方法的潜力的研究相对较少，而且大多数研究都是针对使用骨髓衍生的 MSCs 来设计具有增生软骨特征的软骨结构。这项研究表明，成人鼻软骨细胞可用于生产组织工程化的增生软骨样组织，其形态和表型与生长板内的增生软骨相似。此外，这种工程化的增生软骨一旦植入体内骨缺损处，即可进行血管化并随后形成骨骼。在 14 个月内，只有一份报告显示由鼻软骨细胞（成人人类鼻软骨细胞）形成的增生软骨移植物可以在裸鼠体内进行软骨内骨化。利用鼻软骨细胞产生肥大性软骨是发育工程领域一个令人兴奋的进展，该领域的进一步研究有可能导致生产出一种新的临床骨移植替代品。东莞市富临塑胶原料有限公司 与 Confluent Medical 合作，为中国客户提供“服务”和供应“PGA Biofelt”。
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来源：老刘说科学
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