摘要：N-亚硝基二甲胺（NDMA）和N-亚硝基二乙胺（NDEA）等亚硝胺类化合物被世界卫生组织（WHO）旗下的国际癌症研究署（IARC）列为了2A类致癌物。目前已发现它们以杂质形式存在于多种不同的药品中。
N-亚硝基二甲胺（NDMA）和N-亚硝基二乙胺（NDEA）等亚硝胺类化合物被世界卫生组织（WHO）旗下的国际癌症研究署（IARC）列为了2A类致癌物。目前已发现它们以杂质形式存在于多种不同的药品中。
NDMA和NDEA等亚硝胺类化合物并不是预期的杂质，而是由于药物生产过程中发生了某些化学反应而被引入到API或者成品药中。美国食品药品监督管理局（USFDA）以及欧洲药品管理局（EMA）已经发布了有关药品中基因毒性杂质的允许限量准则，规定暴露于基因毒性杂质的暴露量需低于每天1.5μg的毒理学关注（TTC）阈值。
由于可能存在NDMA和NDEA杂质污染，2018年7月，美国FDA召回了几款含有缬沙坦的药品。EMA也迅速采取行动，禁止了中国和印度某些制造商的沙坦类药物的进口。随着更多新的研究表明，NDMA及NDEA等亚硝胺类基因毒素不仅存在于缬沙坦，氯沙坦等沙坦类药物中，雷尼替丁甚至盐酸吡格列酮中也被发现有亚硝胺类物质的踪迹。2020年4月1日，美国FDA更是要求生产商从市场上撤回所有处方及非处方的雷尼替丁药品。
由于亚硝胺类物质的高极性以及低分子量等特性，寻找一种既稳定，又有高灵敏度的方法就显得尤为重要。目前对于此类物质的分析方法主要有GC-MS/MS和HPLC-MS/MS两种。
气相检测
艾杰尔-飞诺美开发出一个使用ZB-624PLUS气相色谱柱来检测沙坦类药物中NDMA和NDEA含量的方法1。其中对于NDMA的检测灵敏度（LOQ）可以达到1.5 ppb，对于NDEA可达到0.9 ppb。
该方法还选取了两款不同生产批次的缬沙坦药物片剂，采取顶空进样方式进行分析。由于ZB-624PLUS增强了聚硅氧烷主链的交联，从而使其可以在比传统G43固定相更高的温度下使用，并且不必担心色谱柱固定相流失。这些都为ppb级别的检测提供了可能。
色谱柱运行条件：
色谱柱：Zebron ZB-624plus
规格：30mx0.25mmx1.40μm
产品货号：7HG-G040-27
进样：分流 10:1,150℃
顶空进样 1 mL样品于20 mL样品瓶中
载气：氦气,36.1 cm/sec
柱温箱程序：
60 ℃保持 1分钟，之后以20℃/min的速度升至 240℃并保持1分钟
检测器：MSD,250 ℃
样品：
1. NDMA 2. NDEA
图1：GC-MS分析方法使用ZB-624PLUS对NDMA及NDEA的检测（20 ppb标准品）
液相色谱检测
由于灵敏度的限制，UV-Vis检测器在原料药，制剂，甚至饮用水中亚硝胺类化合物的检测中并不常见。美国FDA发布了一种使用Kinetex® 2.6μm F5色谱柱对血管紧张素II受体阻滞剂（ARB）类药物中六种亚硝胺类杂质在液相色谱-高分辨率质谱（HPLC-HRMS）下的检测2。其检测限如下表所示：
表1：六种亚硝胺类杂质使用Kinetex F5色谱柱在HPLC-HRMS下的检测限
注：NEIPA为N-亚硝基乙基异丙基胺，NDIPA为N-亚硝基二异丙胺，NDBA为N-亚硝基二丁胺，NMBA为N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸
在美国FDA发布的该方法中，Kinetex 2.6 μm F5 100 Å, 100 x 4.6 mm（产品货号：00D-4723-E0) 的色谱柱在含0.1%甲酸的水溶液和含0.1%甲酸的甲醇溶液体系下进行了梯度淋洗。由于五氟苯基（PFP）基团可以提供包括疏水性作用，π- π相互作用，偶极矩作用，以及氢键等不同的相互作用，其对于极性较大的亚硝胺类杂质可以提供较好的保留以及分离度。SCIEX也开发出一款使用Kinetex 2.6μm F5色谱柱检测八种不同亚硝胺类化合物的方法3，其定量下限（LLOQ）可达到0.05 μg/g
色谱柱运行条件：
色谱柱：Kinetex 2.6 μm F5
规格：50 x 2.1 mm
产品货号：00B-4723-AN
流动相：
A：0.1% 甲酸的水溶液
B：0.1%甲酸的甲醇溶液
梯度：见技术笔记TN1259
流速：0.5 mL/min
温度：40 ℃
进样体积：10 μL
检测：SCIEX Triple Quad™ 4500
样品相关质谱数据及保留时间如下表：
图2：八种亚硝胺类化合物（左）及空白（右）在Kinetex F5色谱柱上的色谱图
结论：
无论采用气相色谱还是液相色谱检测方法，艾杰尔飞诺美都可以为您提供拥有极低检测限的亚硝胺类基因毒素杂质检测的解决方案。如果您还有其他问题，欢迎与我们技术部门同事在微信及在线咨询平台进行联络。
参考资料：
1.Analysis of NDMA and NDEA in Sartan Drugs and Drug Products by GC-MS on a Zebron® ZB-624PLUS (TN-2080)
2.Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS) Method for the Determination of Six Nitrosamine Impurities in ARB Drugs (FDA)
3.Rapid Analysis of Genotoxic Nitrosamines by HPLC-MS/MS (TN-1259)
来源：拉贝健健康白胖过日子