摘要：用于光动力疗法（PDT）增敏剂局部给药的微针贴剂因其安全性、选择性和非侵入性而具有吸引力。然而，低效光敏剂递送加上缺氧肿瘤微环境的局限性仍然具有挑战性。

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用于光动力疗法（PDT）增敏剂局部给药的微针贴剂因其安全性、选择性和非侵入性而具有吸引力。然而，低效光敏剂递送加上缺氧肿瘤微环境的局限性仍然具有挑战性。

为了克服这些问题，北京大学张俊龙教授/德克萨斯大学奥斯汀分校Jonathan L. Sessler团队开发了一种有效的微针贴片，该贴片基于含有含锌卟啉类似物ZnBP（w）的光敏剂基质内的分子间静电相互作用（方案1）。这种设计提高了微针贴片的机械强度，并提高了水环境中的光敏剂负载效率。本研究强调了静电相互作用在设计微针PDT贴片中的好处及其临床潜力。

相关研究成果以“Electrostatic Force-Enabled Microneedle Patches that Exploit Photoredox Catalysis for Transdermal Phototherapy”为题于2024年12月31日发表在《ACS Applied Materials & Interfaces》上。

方案1 微针PDT贴片的制备及应用示意图

1.ZnBP和NADH之间的静电相互作用

为了使ZnBP具有水溶性，作者制备了一种阳离子衍生物ZnBP (w)。为了在水性介质中检验这种假定的相互作用，通过等温滴定量热法测量了ZnBP (w)和NADH之间的结合常数(K)（图1a、b），结果表明静电相互作用在很大程度上驱动了ZnBP(w)和NADH之间的结合。作者还表明NADH的烟酰胺单元通过静电或π-π分子间相互作用或其中的某种组合与ZnBP (w)相互作用。MD模拟显示ZnBP (w)和NADH在水溶液中聚集的趋势。如图1d所示，这种聚集是由多种相互作用驱动的，例如范德华力和 π-π 供体-受体相互作用（图1e）。此外，NADH的磷酸基团与 ZnBP (w)的Zn中心之间的配位有助于这种结合，Zn-O键长为1.99Å（图1e）。使用sobEDAw方法进行能量分解分析，以量化这种聚集中涉及的稳定力。发现静电相互作用是主要作用力，与交换排斥力（383 kcal/mol）、轨道相互作用（-152 kcal/mol）和色散相互作用（-225 kcal/mol）相比，静电相互作用对总稳定能（-691 kcal/mol）的贡献显著（图1f）。

图1 ZnBP与NADH之间的静电相互作用的验证

2.ZnBP引发的NADH/NAD+光氧化还原反应(w)

作者通过紫外可见吸收光谱法评估了在没有空气或有空气的情况下光诱导NADH/ NAD+ 转化的程度。如图2a所示，在N2气氛中，在光照射（640-660 nm 激光，15 mW/cm2）下，NADH（5 μM 水溶液）在ZnBP (w)（5 μM）存在下转化为NAD+。为了验证这些光谱变化是否与涉及ZnBP (w)和NADH的PET相对应，作者进行了纳秒瞬态吸收光谱(ns-TA)，以监测ZnBP (w)三线态的衰减。这些结果证明ZnBP (w)可以充当PS，在无氧条件下促进NADH转化为NAD+。

当在空气中受到LED激光辐照（640-660，15 mW/cm2）时，光氧化还原催化 NADH/NAD+转化发生，而 ZnBP (w)的吸收基本保持不变（图2c）。值得注意的是，ZnBP (w)比ZnBP (o)效率更高，后者的特点是没有在间位苯基位置修饰的铵基团。这一发现证明ZnBP (w)和NADH之间的静电相互作用在促进观察到的光氧化还原催化中起着关键作用。适当的NADH/NAD+稳态对于线粒体电子传递链(ETC)的顺利运作至关重要。因此，调节NADH/NAD+比率的近红外光驱动的PS系统可能会扰乱细胞氧化还原稳态并促进癌细胞死亡。研究结果表明，一种有前途的方法，即NADH和ZnBP (w)之间的静电和其他支持相互作用促进PET（图2d）。

图2 ZnBP引发的NADH/NAD+光氧化还原反应的说明

3.MN-ZnBP贴片的制备。

MN可以直接刺穿角质层，并通过微孔通道将药物输送到皮肤深层。作者选择了由HA配制的针基。MN-ZnBP (w)负载将通过与HA成分的静电相互作用实现（图3a）。制备 MN-ZnBP (w)贴片后，通过偏光显微镜观察其形态（图3b）。每根针呈圆锥形，底部直径、高度和尖端半径分别为350、900和

图3 微针的制备及特性

4.体外ROS的产生。

接下来，作者研究了MN-ZnBP (w)贴剂溶解后释放的ZnBP (w)是否仍然能够产生1O2和超氧阴离子(O2•−)。结果表明，ZnBP (w)可在细胞中有效产生ROS。由于过量的ROS不可避免地会导致细胞死亡，使用AM/PI试剂盒来评估活细胞/死细胞的丰度，结果显示在激光照射（640-660 nm）下红色荧光（死细胞）水平显著升高（图4f）。ZnBP (w)的细胞毒性明显高于MB(图4g)。此外，ZnBP (w) 的光细胞毒性指数为4,000，这表明ZnBP (w)可以作为潜在的PDT PS发挥作用。

图4 MN贴片在体外的RO生成能力及对细胞的影响

5.基因组分析

为了评估MN-ZnBP (w) 在治疗皮肤病方面的潜力，作者对光照下经MN-ZnBP (w)处理的人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行了转录组分析。根据基因本体BP富集情况，HUVEC中上调最多的三种生理反应包括刺激、细胞过程调节和细胞对有机底物的反应。根据京都基因与基因组百科全书 (KEGG)中最新的生物通路分类条目，确定了与功能或信号通路最相关的差异表达基因。图5a根据p值显示了KEGG通路分析中的前10个项目，包括DNA复制、类固醇生物合成和代谢途径。其中，与细胞死亡密切相关的基因ATF3和HSPA6通过蛋白质印迹法在细胞水平上进行了分析。如图5b所示，经MN-ZnBP (w) 处理后，ATF3和HSPA6蛋白表达量较高。此外，DNA 损伤染色实验表明γ-H2AX表达量较高（图5c）。

图5 转录组分析

6.毛细血管畸形

近来研究表明ROS与血管生成关系密切，中等浓度的ROS可刺激血管生成，有利于新血管的形成和肿瘤的生长。毛细血管畸形，如葡萄酒色痣，是一种先天性疾病，由多种因素引起。因此，作者研究了MN-ZnBP (w)治疗后肿瘤细胞的伤口愈合和上皮细胞的血管增生情况。如图6a、b所示，MN-ZnBP (w)抑制了B16细胞的伤口愈合，从而抑制了其生长。经MN-ZnBP (w)治疗后，24 h后的愈合率仅为3.5% (±3.8%)，而对照组的愈合率为36.6% (±9.4%)。此外，愈合率与浓度有关(图6c)。

此外，作者还使用HUVEC的管形成试验创建了细胞血管模型。用MNZnBP(w)处理后，管变得稀疏或受损，分支节点减少（图6d）。从HUVEC中提取VEGF-A蛋白（一种参与肿瘤血管生成的关键蛋白），发现用MN-ZnBP (w)处理后表达降低（图6f）。上述结果表明 MN-ZnBP (w)可用作抗肿瘤药物或用于治疗浅表血管生成。

图6 MN-ZnBP对血管生成的影响

作者以鸡冠花为毛细血管畸形模型，用手指将MN-ZnBP (w)贴片按压到指定区域。此过程一直持续到MN-ZnBP (w)贴片底衬和针尖自动分离，使MN尖留在皮肤内。然后对鸡冠花进行光照射。21天后，鸡冠花的颜色明显变浅（图7a、b），表明血管退化。相比之下，其他区域没有观察到明显颜色变化（图7c）。H&E染色显示，与对照组相比，MN-ZnBP (w) 治疗组的血管管腔显著减少。为了评估治疗后表皮的恢复情况，通过免疫组织化学分析了鸡冠组织中的胶原酶（图7d）。观察到胶原酶1和COLA1表达的轻微变化，支持MN-ZnBP (w)治疗可诱导皮肤恢复的结论。

图7 以鸡冠花为毛细血管畸形模型验证材料治疗恢复伤口

7.体内抗肿瘤活性

最后，作者在荷瘤B16 BALB/c裸鼠中研究了MN-ZnBP（w）的抗癌活性。选择B16细胞（小鼠黑色素瘤细胞）作为恶性黑色素瘤模型。将小鼠制成约100 mm3的肿瘤后随机分成三组（n=5），分别接受MN-ZnBP (w)激光组、MN-ZnBP (w)-暗组和对照（自由MN-激光）组的治疗。用手指将MN-ZnBP (w)贴片或游离MN按入肿瘤区域进行激光照射（图8a），每2天测量一次肿瘤体积。对照组和MN-ZnBP (w)-暗组未表现出明显的肿瘤生长抑制，而MN-ZnBP (w)-激光组表现出明显的肿瘤生长抑制。MN-ZnBP (w)-激光组的最大肿瘤体积比对照组小32.5%（图8b）。在整个观察期间，小鼠体重没有显著变化，这为MN-ZnBP (w)的安全性提供了支持（图8c）。

H&E染色显示MNZnBP (w)-激光组大多数肿瘤细胞体积减小，且细胞核和细胞质分布不均匀，损伤明显。相比之下，对照组和MN-ZnBP (w)-暗组的细胞核和细胞质分布相对均匀，细胞形态正常。为了评估肿瘤细胞凋亡的程度，作者使用了末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)试验(图8d)。MN-ZnBP (w)-激光组肿瘤组织中的凋亡细胞呈现绿色荧光，而对照组和MN-ZnBP (w)暗组几乎未观察到信号。这些结果支持使用MNZnBP (w)作为安全性良好的局部PDT治疗。

图8 MN贴片用于体内抗肿瘤实验

为了测试MN-ZnBP (w)贴片是否比静脉注射ZnBP (w)引起的光毒性更小，作者使用BALB/c小鼠作为光敏模型进行了体内实验（图9a）。iv-ZnBP (w)组的小鼠出现了严重的光毒性反应：它们的体温从大约38.6 °C显著下降到32.2 °C（图9b、c），并且它们表现出肌肉无力和爪子卷曲（图9d）。相比之下，MN-ZnBP(w)组小鼠没有出现爪子卷曲或体温过低的现象，这表明MN-ZnBP (w)贴剂的毒性比静脉注射ZnBP (w)要小得多。

接下来，对静脉注射ZnBP (w)和MN-ZnBP (w)贴剂进行了药代动力学研究。得到的平均血浆浓度-时间曲线如图9e所示。MN-ZnBP (w) 组的最高浓度是静脉注射 ZnBP (w) 组的五分之一，充分说明了MN-ZnBP (w)贴剂的安全性。

图9 MN-ZnBP (w)贴剂的安全性验证

综上，本文开发了一种用于PDT的MN-ZnBP（w）贴剂。该设计依赖于PS和带负电荷的HA基质材料之间的静电相互作用，从而提高了MNZnBP (w)贴片的机械强度，并提高了PS在水介质中的加载效率。这反过来又导致局部给药时PDT疗效增强，并减少静脉给药相关的全身光毒性。研究发现，ZnBP (w)可以与包括NADH在内的生物电子供体结合，在光辐射下促进有效的电子转移。在光照射下，MN-ZnBP (w)贴片有效抑制血管上皮细胞的增殖，并在亮红色痣中表现出抗毛细血管畸形的作用，降低其表面颜色。本文开发的MN-ZnBP (w)局部PDT给药贴片可以为控制皮肤病提供一种有前途的方法。

来源：EngineeringForLife