摘要：在自然生态系统中，微生物能够稳定地定殖在植物叶片上，克服叶片所处环境的波动变化。而针对叶际微生物群如何影响单片叶子的生长，人们对此仍知之甚少。在此，我们研究了在三种养分和水分含量不同的土壤中生长的玉米（玉米/谷物）植株叶片的生长情况，并确定了由叶片微生物群驱动

研究论文

● 期刊：Cell Host & Microbe(IF:20.6)

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● 发表日期：2025-2-27

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亮点Highlight

● 定殖于幼叶上的优势细菌驱动单叶生长。

● 防御相关信号网络整合叶片微生物群影响叶片发育。

● 叶片微生物群通过抑制遗传网络来调节生长与防御之间的平衡。

● 由叶片微生物群和叶片年龄所驱动的机制实现了单叶生长平衡。

摘要Abstract

在自然生态系统中，微生物能够稳定地定殖在植物叶片上，克服叶片所处环境的波动变化。而针对叶际微生物群如何影响单片叶子的生长，人们对此仍知之甚少。在此，我们研究了在三种养分和水分含量不同的土壤中生长的玉米（玉米/谷物）植株叶片的生长情况，并确定了由叶片微生物群驱动的促进叶片生长的效应，这一点也在田间研究中得到了验证。我们构建并使用了一组细菌菌株进行再定殖实验，以研究微生物群介导的促进叶片生长相关的机制。我们证明，栖息在幼叶上的常见细菌能够促进单片叶子的生长。通过转录组分析，我们揭示了一个与防御相关的遗传网络，该网络将叶际微生物群的有益作用整合到了叶片发育进程之中。我们证明，单片叶子的微生物群会以不同的方式抑制这一遗传网络，从而调节单片叶子生长与防御之间的平衡。

结果Result

叶片的生长进程整合了外部信号

为了确定在生态相关条件下玉米叶片生长的主要驱动因素，我们在受控条件下，将玉米（玉蜀黍）野生型B73，以及非洲常用的自交系CVSt、Matuba和Zm523种植在来自佛得角圣地亚哥岛的两种天然土壤（塔拉法尔和圣多明戈斯，两地相距约33.49千米）中，以及来自英国的一种土壤（萨顿-博宁顿校区，距佛得角约4635千米）中（图1A）。这些非洲土壤中，一些对植物生长很重要的矿质养分（如磷和铁）的浓度同样较低，土壤孔隙度相似。并且，这些土壤每年所经历的雨季都非常短，这限制了该岛上玉米的生长和产量（图S1A-S1C）。这些土壤在物理和化学性质上的相似性，使我们能够评估土壤生物成分对植物生长的影响。相比之下，佛得角土壤的这些特性与英国土壤不同，英国土壤经常经历降水，并且具有不同的矿质养分特征（图S1A-S1C），这使我们能够评估影响叶片生长的土壤生物成分与土壤物理化学性质之间的相互作用。

图1 | 玉米叶片的生长可能会受到非生物因素和生物因素的影响

（A）本研究中所使用的三种土壤的来源地点。

（B）在所用的三种土壤中生长的玉米野生型B73植株的代表性照片。

（C）玉米叶片的总长度。

（D）单片玉米叶（L）的长度。

（E）在所用的三种土壤中生长的植株的总根干重。在（C）和（D）中，统计学显著性通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验（Kruskal-Wallis test），随后进行邓恩事后检验（Dunn’s post hoc test）来确定。在（E）中，统计学显著性通过线性建模来确定，字母代表图基事后检验（Tukey post hoc test）的简洁字母显示法。

对于每种植物基因型，我们测量了叶片总长度，即单株植物上所有叶片长度的总和，以此作为衡量植物生长的指标（图S1D-S1F）。为了尽量减少因土壤水分可利用量和植物发育情况不同而导致的植物生长差异，在每种情况下，都将土壤含水量控制在其持水能力的50%（图S1G；表S1），并且所有植株都在V4（四片完全展开的叶子）发育阶段进行收获（图S1H）。我们发现，与种植在萨顿-博宁顿土壤中的植株相比，种植在圣多明戈斯土壤中的玉米植株，其叶片总长度并未显示出显著差异，尽管两种土壤中的矿质养分含量明显不同（图1B、1C、S1A、S1B和S1E）。正如预期的那样，种植在塔拉法尔土壤中的植株明显比种植在其他土壤中的植株小（图1B、1C和S1E），并且这些植株的发育出现了延迟（图S1H）。这些发现与以下事实相符，即这些植株是种植在塔拉法尔的土壤中，而该土壤中对植物发育重要的矿质养分已被耗尽（图S1A和S1B）。在所有分析的基因型中，这些差异都很明显（图S1D）。所有这些结果表明，叶片发育过程不仅整合了土壤中矿质养分的可利用情况，还整合了其他可能调节叶片生长的生物和非生物环境因素。

我们注意到，不同土壤中叶片总长度的差异并未完全体现在单片叶子的层面上（图1D）。在所有情况下，第一片叶和第二片叶在不同土壤中的长度均未显示出差异（图1D）。相反，第三片叶、第四片叶和第五片叶在不同土壤中的长度存在显著差异，这重现了在叶片总长度中所观察到的差异（图1B–1D）。这可能表明，第一片叶和第二片叶的生长利用的是种子中储存的资源，并且它们对外界控制叶片生长的因素也具有抗性。相比之下，其余叶片的生长遵循的发育过程可能会受到外部信号的影响。

总体而言，我们在所分析的基因型中发现了根干重方面的显著差异（图S1I），但这些差异并非特定于某一种土壤类型（图1E和S1I）。此外，我们观察到，在不同的土壤中，根干重与叶片长度之间存在较弱的相关性（圣多明戈斯和塔拉法尔土壤）或没有相关性（萨顿-博宁顿土壤）（图S1J）。因此，我们排除了与根系相关的土壤探索功能是导致所观察到的植物叶片生长差异的主要原因这一可能性。

叶片中的矿质养分含量并不能完全解释其生长情况

为了探究矿质养分和微量元素（离子组）的积累是否能够解释玉米植株中存在的生长差异，我们测定了单片叶子的离子组情况。我们发现，单片叶子具有独特的离子组特征（图2A、S2A和S2B）。与先前的研究文献一致，无论用于种植它们的土壤是什么，这种单片叶子的离子组特征在所有植物基因型中都保持不变（图2A、S2A和S2B）。此外，在所有土壤中，一些矿质养分与叶片年龄呈显著正相关（磷）和负相关（镁、钙、锶、锰和钼）（图S2A-S2C）。在田间条件下生长的植株中，单片叶子具有不同离子组的这一发现也得到了证实（图S2D和S2E）。

图2 | 叶片矿质养分特征的变化可能并不足以预测其生长情况

（A）主成分分析（PCA）展示了在三种所用土壤中生长的玉米植株的单片叶子（L）的离子组投影情况。左侧的条形图表示不同实验变量所解释的方差百分比。

（B）对在三种所用土壤中生长的玉米植株的单片叶子（L）的矿质养分特征进行曼特尔相关性分析（Mantel correlation analysis）得到的相关系数（r）值。橙色条形表示q值小于0.05的r值。

尽管在不同土壤中，单片叶子具有独特的离子组特征，但每片叶子内某些矿质养分的浓度确实会根据土壤中这些养分的可利用程度而发生变化（图2A、S1B、S2A和S2B）。例如，在佛得角的两种矿质养分含量相近的土壤中生长的植株，尽管其叶片生长情况存在显著差异（图1B-1D、2B、S1B、S2A和S2B），但它们的单片叶子却呈现出相似的离子组特征。正如预期的那样，在萨顿-博宁顿土壤中生长的植株的叶片显示出最为独特的离子组特征，尽管它们的叶片生长情况与在圣多明戈斯土壤中生长的植株相似（图1B-1D、2B、S1B、S2A和S2B）。这些结果表明，对于已被微生物群定殖的植株而言，其叶片矿质养分特征的变化可能并不足以预测叶片的生长情况。

叶片微生物群可能会影响叶片的生长

接下来，为了探究植物微生物群组成是否导致了在不同土壤中观察到的植物叶片生长差异，我们分别利用16S rRNA基因和核rRNA的内转录间隔区（ITS）的DNA扩增子测序技术，对在根、叶以及盆栽土壤中定殖的细菌和真菌群落进行了分析。正如预期的那样，从土壤到根再到叶，细菌和真菌的α多样性逐渐降低（香农指数，p

我们观察到，在CAP分析的第一轴上，细菌和真菌群落均根据样本组分而分离（图S3C）。在CAP分析中，我们发现土壤和根的细菌和真菌群落组成存在显著差异，这主要可由土壤的地理位置来解释（图S3D和S3E）。对于叶片细菌微生物群而言，这些差异不太明显，其组成差异可由土壤和叶片年龄来解释（图S3F）。我们发现，在我们的研究体系中，叶片真菌群落组成的差异无法用土壤类型来解释（图S3F），这表明，在我们的实验条件下，诸如温度、湿度或植株间距离等环境因素（在我们的实验中这些因素是恒定的），对于叶片真菌群落的形成而言，可能比土壤特征更为重要。因此，我们排除了叶片真菌种群是导致在所使用的土壤中观察到的叶片生长促进差异的主要驱动因素这一可能性。此外，我们观察到，在圣多明戈斯和萨顿-博宁顿土壤中生长的植株，其叶片定殖的细菌属的重叠程度（这两种土壤对叶片生长的促进作用相似），明显高于根微生物群的相同重叠程度（图S3G）。所有这些结果都表明，与根际微生物群相比，定殖在植物叶片上的特定小群细菌在控制所使用土壤中叶片生长促进方面起着主要作用。事实上，我们发现，在所有使用的土壤中生长的植株，其叶片细菌组成的差异与叶片长度的差异之间存在显著相关性（图S3H）。当我们使用根际细菌群落组成的差异时，这种相关性不太明显（图S3H），而对于叶片和根际真菌群落组成的差异而言，这种相关性并不显著（图S3I）。

因此，为了证实这一观察结果，我们确定了在不同植物部位和所使用土壤中细菌扩增子序列变异体（ASV）的富集情况。为了减少地理因素和特定样本特征对分析的影响，我们仅选择了样本中丰度最高且最普遍存在的ASV（相对丰度为0.01%，出现频率为57%）。与我们之前的结果（图S3D-S3H）一致，我们在两种非洲土壤中检测到了类似的富集模式，与土壤相比，大量的ASV在叶片中减少或富集，而在根中的程度较小（图S3J）。重要的是，我们注意到，叶片中显著富集或减少的ASV数量高于根中发现的数量（图S3J）。这些观察结果在不同的分类水平上得到了证实（图S3K和S3L）。因此，我们得出结论，在不同土壤中观察到的玉米叶片长度差异不能仅由叶片细菌群落的一般特征来解释，这很可能主要是每片叶子所代表的生态环境、每片叶子特有的一组微生物以及叶片的内源性发育程序之间新兴相互作用的结果。

为了验证这一假设，我们首先分析了玉米单片叶子中细菌群落的成员特征。我们发现，α多样性从老叶到幼叶逐渐降低（图S3M），这可以由细菌群落的环境筛选差异和/或老叶与幼叶之间暴露于微生物定殖的时间差异来解释。与离子组学结果（图2A）一致，我们发现单片叶子具有独特的细菌群落，并且这种分布在所有土壤中都保持一致，这表明单片叶子支持着独特的细菌群落结构的生长（图3A）。这些观察结果在田间条件下生长的玉米植株中得到了证实（图S3N）。

图3 | 少量的高丰度细菌群体可能会影响玉米叶片的生长

（A）CAP分析展示了每片单独叶片（L）的细菌组成特征投影情况。每个图中均显示了置换多元方差分析（PERMANOVA）的R²值和p值。

（B）在不同所用土壤中生长的玉米植株叶片之间共有的高丰度细菌属的数量。橙色条形所代表的情况与我们用作参考的萨顿-博宁顿和塔拉法尔植株之间的类似比较结果存在显著差异（p值

（C）对在三种所用天然土壤中生长的植株，分析其叶片的矿质养分特征（离子组）与微生物组组成之间的相关性。每个图中均显示了曼特尔r统计量以及通过10000次置换得到的p值。

我们推断，能够在每片叶子所代表的不同环境中定殖的细菌所必需具备的特性，最常存在于叶片中高丰度的细菌分类群里。于是，我们确定了在三种土壤中每片单独叶片的高丰度细菌属（Z分数 > 0.5）。根据我们的假设，这些高丰度的细菌类群使叶片之间微生物组组成的差异达到了最大化（图S3O）。重要的是，我们观察到，在圣多明戈斯土壤和萨顿-博宁顿土壤中生长的植株，它们的叶片长度相似，而这些植株叶片之间共有的高丰度细菌属的数量，通常比在塔拉法尔土壤和萨顿-博宁顿土壤中生长的植株（其叶片长度不同）叶片之间共有的高丰度细菌属的数量要多（图3B）。这可能表明，在圣多明戈斯土壤中生长的植株所观察到的生长促进现象，可能是由定殖在叶片上的一小群高丰度细菌的存在所决定的，而不是由叶片的矿质养分构成所决定的。事实上，我们并未检测到单片叶子的微生物组成与其矿质养分组成之间存在显著的相关性（p

玉米源细菌菌种保藏

为了证明栖息在玉米单片叶子上的高丰度细菌是如何调节叶片生长的，我们首先构建了一个细菌菌种保藏库。我们从在三种所用土壤中生长的12株玉米（Zea mays）B73植株的根和地上部分离出了单个细菌菌株。将地上部分和根的组织片段用氯化镁冲洗三次后进行匀浆处理，然后将得到的悬浮液接种到十种具有不同细菌筛选能力的琼脂培养基和液体培养基上。通过这种方法，我们成功分离出了2169个细菌菌株。去除重复菌株后，我们鉴定出了395个细菌分离株，它们分属于γ-变形菌纲（59.5%）、放线菌纲（18.5%）、α-变形菌纲（10.1%）、芽孢杆菌纲（10.1%）和拟杆菌门（1.8%）（图S4A；表S2）。这个细菌保藏库包含的细菌目成员，分别约占在天然土壤中生长的玉米植株叶片和根部位样本总相对丰度的72%和63%（图S4B）。这个细菌保藏库为我们提供了一种工具，可用于在受控条件下的再定殖实验中确定支撑叶片生长的分子机制。

来自单片叶子的细菌群落会影响叶片的生长

为了了解微生物群是如何与叶片发育的内源性程序相互交织的，我们设计了一个基于沙质黏土的系统，该系统降低了土壤结构的复杂性。利用这个系统，我们模拟了萨顿-博宁顿土壤的持水能力，通过5份沙子和1份黏土的混合物，我们模拟出了在三种所用土壤中最高的持水能力（图S4C）。为了维持无菌条件，所有花盆都被放置在干净的塑料盒中，盒盖上装有过滤器。我们首先测定了在四种不同养分浓度（无霍格兰培养液、1/4浓度霍格兰培养液、1/2浓度霍格兰培养液和全浓度霍格兰培养液）下生长的野生型B73植株的单片叶子长度。我们观察到，根据所用矿质养分的浓度，叶片长度呈线性变化（图S4D）。对于第3、4和5片叶，这种随叶片年龄变化的影响也能观察到（图S4E）。与我们在天然土壤中的实验结果（图2A、S2A和S2B）一致，沙质黏土基质中的养分浓度影响了单片叶子的离子组（图S4F和S4G）。这表明，在无菌条件下，增加沙质黏土基质中无毒浓度的矿质养分，会以线性方式对植物叶片生长产生积极影响。当我们向这种沙质黏土基质中添加从三种土壤中提取的天然微生物群落时，我们重现了接种了萨顿-博宁顿和圣多明戈斯微生物群落的植株叶片生长得到促进的现象，而接种塔拉法尔土壤微生物群落的植株则没有这种现象（图S4H）。基于这些观察结果以及我们在天然土壤实验中得到的结果（图3和S3），我们假设，在圣多明戈斯天然土壤中生长的植株上观察到的出乎意料的叶片生长促进现象（图1B-1D），可能主要是由栖息在叶片上的细菌群落所决定的。

为了验证这一假设，我们利用我们的细菌分离株保藏库设计了一个由210个成员组成的合成群落（SynCom）（图S4A）。用于合成群落的细菌菌株覆盖了在天然土壤中生长的玉米植株叶片中发现的所有细菌目总相对丰度的72%（图S4B；表S3）。为了给合成群落完全确定分类属性，我们对所有单个细菌菌株的基因组进行了测序。将细菌合成群落接种到装有无菌沙质黏土（质量比5：1）基质和已预发芽的B73种子的花盆中，并添加两种浓度的霍格兰培养液，即低浓度（1/4浓度霍格兰培养液）和全浓度，以模拟佛得角两种土壤中的低养分浓度以及英国富养分土壤的情况。作为对照，我们还让B73植株在无菌条件下（不接种细菌合成群落）生长。我们观察到，在两种所用养分浓度下，与未接种的对照植株相比，接种的玉米植株叶片均有生长促进效果（图4A）。在低养分条件下，细菌合成群落使植株生长提升到了在充足养分条件下生长的植株的水平（图4A）。与我们之前使用天然土壤进行的实验结果一致（图1B），只有后期长出的叶片才会对微生物群对生长的积极影响产生响应（图4A）。

图4 | 叶片标记物影响叶片生长和微生物群结构

（A）在基于沙质黏土的系统中生长的玉米野生型B73植株的单片叶子（L）长度，该系统补充了全浓度霍格兰培养液（高浓度）或1/4浓度霍格兰培养液（低浓度），且分别接种了完整的合成群落（+SynCom）或未接种（无细菌[NB]）。在每种情况下，统计学显著性均通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验（Kruskal-Wallis test），随后进行邓恩事后检验（Dunn’s post hoc test）来确定。

（B）CAP分析展示了玉米植株每片单独叶片（L）的细菌组成特征投影情况。每个图中均显示了置换多元方差分析（PERMANOVA）的R²值和p值。

（C）在基于沙质黏土的系统中生长的野生型植株的单片叶子（L）长度，该系统补充了低养分（1/4浓度霍格兰培养液），且分别接种了完整的合成群落（+SynCom）、四种缺失部分菌株的合成群落或未接种（无细菌 [NB]）。统计学显著性通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验（Kruskal-Wallis test），随后进行邓恩事后检验（Dunn’s post hoc test）来确定。

（D）CAP分析展示了玉米植株每片单独叶片（L）的细菌组成特征投影情况。每个图中均显示了置换多元方差分析（PERMANOVA）的R²值和p值。

接种了合成群落（SynCom）的植株的叶片，其微生物群特征与在三种天然土壤中生长的植株的叶片微生物群特征存在相同之处。正如预期的那样，无论是在低养分还是高养分条件下，α多样性从根到叶逐渐降低，并且从老叶到幼叶也逐渐降低（图S4I）。在CAP分析中，细菌群落根据样本组分而分离（图S4J）。在低养分和高养分浓度条件下，单株植物的叶片都显示出独特的细菌群落（图4B）和矿质养分构成（图S4K和S4L）。

为了了解微生物群在控制玉米叶片生长方面所起的作用，我们首先确定了具有一定叶片特异性水平的细菌分离株类群（图S4M）。我们发现了一些细菌菌株，它们优先定殖在不同的玉米叶片上，且在叶片样本中具有相对较高的丰度（>0.001）和出现频率（>15%）。然后，这些细菌菌株被归类为“叶片标记细菌”（图S4M；表S3）。为了确定叶片标记细菌与叶片生长之间的因果关系，我们比较了接种完整合成群落的植株的叶片长度，以及接种了四种设计为依次去除单个叶片标记细菌的合成群落的植株的叶片长度（图S4M和S4N；表S3）。我们发现，当从完整的合成群落中去除第3片叶的叶片标记细菌（16个菌株，分属于γ-变形菌纲、芽孢杆菌纲和放线菌纲）、第4片叶的叶片标记细菌（18个菌株，分属于γ-变形菌纲、α-变形菌纲、放线菌纲和拟杆菌纲）以及第5片叶的叶片标记细菌（3个菌株，分属于γ-变形菌纲和放线菌纲）时，完整合成群落对第3片叶、第4片叶和第5片叶生长的促进作用就消失了（图4C；表S3）。为了进一步证实这些观察结果，我们量化了所有单片叶子中维管束鞘细胞的大小，以此作为细胞扩张（一个控制叶片发育的过程）的指标。在接种了完整细菌合成群落的植株中，我们观察到，与在无菌条件下生长的植株的相同叶片相比，接触完整合成群落的植株的第3片叶、第4片叶和第5片叶的维管束鞘细胞通常明显更小（图S4O）。这些结果有力地表明，微生物群驱动的叶片生长促进作用不是通过细胞扩张实现的，而是通过细胞增殖实现的。我们还测试了，仅接种第3片叶、第4片叶和第5片叶的细菌标记物不足以诱导玉米植株的生长促进，这表明叶片细菌标记物对于诱导对叶片生长的积极影响是必要的，但并非充分条件，还需要适当的微生物环境（图S4N和S4P；表S3）。此外，我们注意到，从完整的合成群落中依次去除叶片标记细菌会扰乱单片叶子的微生物群结构（图4D）。这些结果表明，玉米叶片的生长可能受到数量较少但能有效定殖在幼叶上的关键微生物的影响。

为了探究叶片微生物群是否足以诱导植物地上部分生长的变化，我们在低养分条件下，用完整的合成群落和去除了叶片标记细菌的合成群落分别接种了多根紫萍（Spirodela polyrhyza），这是一种属于浮萍科的单子叶水生植物。这种植物的根被证实是退化器官，所以多根紫萍植株可以在没有根的情况下在琼脂平板上繁殖。使用无根的多根紫萍，我们重现了在完整玉米植株上得到的结果。我们观察到，与未接种的植株以及接种了10倍浓缩的热灭活合成群落的植株相比，完整的合成群落显著促进了植株的生长（图S4Q-S4S）。在接种了去除了第3片叶、第4片叶和第5片叶标记细菌的合成群落的植株中，这种积极作用不存在（图S4Q-S4S）。当我们使用有根的植株重复这个实验时，也得到了类似的结果（图S4Q-S4S）。因此，这些结果表明，在无根及其微生物群的作用下，叶围微生物群足以且有必要诱导多根紫萍植株地上部分的生长促进，并且已确定的叶片标记细菌对于这一功能起着关键作用。

微生物群通过抑制防御相关的网络调节叶片生长

为了确定有益微生物群对玉米叶片生长产生作用的潜在机制，我们分析了在低养分浓度下无菌生长的B73玉米植株的第3片叶、第4片叶和第5片叶的转录反应，这些植株分别接种了完整的合成群落（SynCom），以及三种去除了第3片叶、第4片叶和第5片叶的叶片标记细菌的合成群落。

我们首先比较了接种完整合成群落的B73野生型植株单片叶子中的差异表达基因（DEGs），与接触三种去除了叶片标记细菌的合成群落且对叶片生长产生相反影响的野生型植株单片叶子中的差异表达基因。我们推断，这些处理之间的差异表达基因可能与微生物群驱动的叶片生长促进机制有关。通过这种比较，我们确定了在完整合成群落作用下，不同单片叶子中独特的转录特征，其中包括在第3片叶中显著诱导和抑制的279个和197个基因，在第4片叶中显著诱导和抑制的107个和16个基因，以及在第5片叶中显著诱导和抑制的41个和16个基因（图S5A和S5B；表S4）。对于第3片叶和第4片叶而言，这些对微生物群有响应的基因总体上与光合作用、植物防御以及其他细胞代谢过程相关，而在第5片叶中则与光合作用和蛋白质代谢相关（图S5C；表S5）。

为了补充我们的分析，我们还在单片叶子的转录组中确定了那些其表达对完整合成群落有响应且与叶片生长相关的基因。通过这种方法，我们确定了在第3片叶中分别有145个和314个基因被诱导和抑制，在第4片叶中分别有71个和51个基因被诱导和抑制，在第5片叶中分别有768个和1569个基因被诱导和抑制，这些基因与叶片生长具有高度相关性（-0.46 > r > 0.46，p值

与未接种或接种了三种去除了叶片标记细菌的合成群落的植株相比，接种了完整合成群落的玉米植株表现出相反的叶片生长表型。因此，我们仅将那些在接种完整合成群落的植株与未接种或接种了三种去除了叶片标记细菌的合成群落的植株之间通常表现出相反转录反应的基因簇，视为控制微生物群驱动的叶片生长促进机制的候选基因。通过这种筛选方法，我们在第3片叶中确定了三个符合这种表达模式的差异表达基因簇（C4、C6和C8）（图S5H和S5I）。在第4片叶和第5片叶中，我们没有发现符合这种表达模式的基因簇（图S5J和S5K），但我们注意到，在第4片叶和第5片叶中，第3片叶中已确定的基因簇C4、C6和C8的抑制程度不那么明显（图S5L）。在那些被发现与叶片生长相关的基因中，我们确定了基因簇CR8C，它在第3片叶中对接种完整合成群落有响应而被抑制，对接种三种去除了叶片标记细菌的合成群落以及在无菌植株中有响应而被诱导（图S5M和S5N）。与我们之前的结果（图S5H、S5J和S5K）一致，在第4片叶和第5片叶中，我们没有发现符合相同表达模式的基因簇（图S5O和S5P），并且从第3片叶到第4片叶和第5片叶，CR8C基因的抑制作用越来越不明显（图S5Q）。因此，从第3片叶到第5片叶，植物抑制已确定基因簇的能力逐渐下降，这表明植物会根据叶片年龄调整对这一调控回路的抑制程度，以响应微生物群来促进叶片生长。

我们注意到，用于基因选择的方法是互补的，在每种情况下分别确定了139个和62个独特的基因，并且只有2个基因是通过两种方法都能确定的（图5A和S5R；表S8）。这203个基因高度富集于与植物防御相关的基因中（图5B和5C），它们的表达通常在单片叶子中对微生物群有响应而受到差异抑制（图5C和5D），其中一小部分，即14个基因，此前已被确定为其他控制拟南芥中防御与生长权衡的遗传调控网络的成员（图S5S）。因此，我们假设，单片叶子的微生物群通过在单片叶子水平上对生长与防御权衡机制的特定调节，来影响叶片的生长。

图 5 | 叶片微生物群通过抑制富含防御相关基因的基因簇调节叶片生长

（A）对所鉴定的203个基因进行的层次聚类分析。与无菌植株（无细菌 [NB]）以及接种了三种去除部分菌株的合成群落（SynCom）的植株相比，在接种完整细菌合成群落（+SynCom）的植株中，这些基因在第3片叶中受到更强的抑制。

（B）每个基因簇中防御相关基因的比例。虚线表示在整个玉米基因组中防御相关基因的比例。浅灰色条形表示显著富集（p

（C）热图展示了在（A）所示分析中鉴定出的68个防御相关基因的标准化表达情况。

（D）（C）中所示防御相关基因在接种或未接种（无细菌 [NB]）完整合成群落（+SynCom）的野生型植株的第3片叶、第4片叶和第5片叶中的标准化表达情况。黑色线条表示具有统计学显著性（p

（E）使用qPCR对禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）的生长进行定量分析。在接种（SynCom）或未接种（无细菌 [NB]）合成群落的植株叶片中进行定量。每种情况均使用了四株独立的植株。

为了验证这一假设，我们通过实时定量聚合酶链式反应（qPCR）评估了真菌病原体禾谷镰刀菌在玉米植株B73单片叶子上的生长情况（图5E）。与无菌植株的第3片叶相比，在低养分条件下被合成群落定殖的植株的第3片叶对该病原体明显更为敏感（图5E）。在被合成群落定殖的植株中观察到的这种对病原体的易感性模式，在第4片叶中不太明显，在第5片叶中则更不明显（图5E）。因此，在被合成群落定殖的植株中，从第3片叶到第5片叶，植物对禾谷镰刀菌的易感性逐渐降低（图5E），这与在RNA测序（RNA-seq）实验中确定的由微生物群驱动的对防御相关基因的转录抑制情况相符（图5C和5D）。

接下来，我们探究了细菌对叶片生长的影响是否与已知的、在无菌植株中控制叶片发育的叶片激素特征变化有关。因此，我们对在无菌条件下生长或接种了完整合成群落的植株的第3片叶的激素特征进行了定量分析，第3片叶对细菌处理的转录反应最为显著。我们没有检测到植物激素生长素、赤霉素、脱落酸和细胞分裂素的积累在对细菌处理的响应上存在显著差异（图S6A）。这表明，由微生物群驱动的调节叶片生长的机制可能与这些叶片激素特征的变化没有直接关系。

调控网络的组成部分在植物中可能具有保守的活性

为了最大程度地成功评估已确定的调控基因回路在控制细菌对叶片生长的影响方面所起的作用，我们专注于验证在植物中具有保守活性的调控基因。我们推断，尽管玉米和拟南芥在叶片发育和免疫系统方面存在差异，但调控网络中的一些关键基因在这两种植物中可能具有保守性。因此，我们首先验证了完整的细菌合成群落（SynCom）对拟南芥莲座叶生长的积极影响（图S6B）。与在玉米中得到的结果一致，在高养分和低养分条件下生长的植株中，完整的合成群落都促进了莲座叶的生长（图S6B）。接下来，我们测试了植物免疫相关基因的转录诱导是否随叶片年龄而变化。我们发现，与老叶相比，拟南芥中的五个经典防御基因在幼叶中受到的诱导作用更强（图S6C）。当我们分析在玉米中确定的四个同源基因的表达时，观察到了类似的转录反应，这些基因是控制植物响应微生物群而进行叶片生长的遗传回路的一部分（图S6D；表S9）。这些结果可能表明，当存在微生物群时，控制单片叶子生长的机制在拟南芥植株中也可能存在。

然后，我们确定了拟南芥中37个纯合的T-DNA（转座DNA）突变株系，这些突变株系针对的是在玉米中确定的一些同源调控基因（图5A-5C；表S9）。这种基因选择涵盖了在玉米中确定的大多数选定基因簇（图S6E）。我们对所有拟南芥突变株系进行了筛选，以评估它们在低养分条件下（1/400 Murashige和Skoog基本盐混合物 [MS]）接种完整合成群落时增加植株地上部分大小的能力。我们发现，与野生型植株相比，三个拟南芥T-DNA突变体（占8.1%）在接种完整合成群落时，其地上部分的生长显著增加（图S6F）。

为了增强植物与细菌合成群落之间的相互作用，我们在极低养分条件下（1/1000 MS）重复了这一筛选过程。在这些极端的营养条件下，野生型植株失去了响应细菌合成群落而增加莲座叶大小的能力（图S6G）。与转录抑制机制一致的是，在无菌和极低养分条件下，我们通过遗传学方法在16个突变体（占43.2%）中重现了细菌合成群落对地上部分生长的影响（图S6G）。在存在合成群落的情况下，这种影响在10个和4个突变株系（占37.8%）中分别得以保留或显现（图S6H）。因此，我们确定了这个调控基因网络中的一些组成部分，它们在控制拟南芥响应微生物群而进行的地上部分生长方面发挥着积极作用。

接下来，为了选择要在玉米中进行验证的候选基因，我们采用了严格的选择标准。我们仅将At2g45910、At2g30250、At4g11650、At5g07120这四个基因的突变体视为强有力的候选基因，因为它们在接种细菌的植株和无菌植株之间表现出显著不同的地上部分生长情况（图S6I）。此外，我们通过比较拟南芥野生型和突变植株在存在或不存在细菌合成群落、低养分或充足养分条件下对坏死性真菌灰葡萄孢菌感染的敏感性，来验证这一选择。我们发现，在低养分条件下，与无菌植株相比，被合成群落定殖的野生型植株对灰葡萄孢菌感染更为敏感（图S6J和S6K）。在充足养分条件下生长的植株中，这些差异不太明显（图S6J和S6K）。正如对控制响应微生物群的生长与防御权衡机制的调控基因所预期的那样，在低养分条件下生长的At2g45910和At2g30250基因的突变株系中，我们没有检测到无菌植株和接种合成群落的植株在病原体感染方面存在显著差异（图S6J和S6K）。

由微生物群介导的转录抑制系统控制生长与防御的权衡机制

为了验证在拟南芥中鉴定出的基因活性降低是否会影响玉米的叶片生长，我们找出了基因zm00001eb022810（对应拟南芥基因At2g45910，有两个等位基因：UFMu-00071和BonnMu-4-A-1474；编码植物U-box型E3泛素连接酶）、zm00001eb290350（对应拟南芥基因At2g30250，有两个等位基因：UFMu-08215和AcDs-00561；编码WRKY25）和zm00001eb149250（对应拟南芥基因At5g07120，有三个等位基因：UFMu-00136、UFMu-09182、UFMu-11121；编码分选连接蛋白SNX2b）的可用Mu转座子突变体，这些基因的拟南芥同源基因已被选为有力候选基因（图S6G-S6I和S6L）。在低养分条件下（1/4霍格兰营养液），将所有Mu转座子突变体分别接种或不接种完整的合成群落，并测量叶片生长情况。与拟南芥的研究结果一致，且符合转录抑制机制的预期，我们发现，所选的两个基因zm00001eb022810和zm00001eb290350的活性降低，会使玉米在接种合成群落时叶片生长得到促进（图6A）。在这些玉米突变体的单片叶子中也证实了这一效果（图S6M）。通过实时定量PCR，我们证实，与野生型W22植株相比，在这些玉米突变体中，属于已鉴定调控回路的六个防御相关基因（图5）的表达受到合成群落的差异调控（图6B和S6N）。我们发现，在野生型植株中，接种合成群落时这六个基因的抑制程度从第3片叶到第5片叶会典型性降低，但在突变体中并未出现这种情况（图6B、S6N和S6O）。与野生型植株相比，在突变体的第4片叶和第5片叶中，这些防御相关基因仍受到更强的抑制（图6B）。这些结果表明，在这些突变植株中，生长-防御权衡机制的激活失去平衡，生长优先于防御。

图6 | 一种由微生物群和叶片年龄驱动的机制通过对生长与防御的差异化激活来平衡单叶生长

（A）在低养分条件下，对接种了完整合成群落（+SynCom）的玉米野生型B73和W22植株，以及基因zm00001eb022810、zm00001eb290350和zm00001eb149250的Mu转座子突变体，测定其叶片总长度。统计学显著性通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验（Kruskal-Wallis test），随后进行邓恩事后检验（Dunn’s post hoc test）来确定。

（B）在本研究中鉴定出的六个调控基因，其在接种或未接种完整合成群落的单片叶子（L）中的抑制水平之间的倍数变化。图中的黑点表示对所有基因分析得到的倍数变化的平均值。

（C）使用实时定量PCR对野生型植株和接种（SynCom）或未接种（无细菌 [NB]）合成群落的Mu转座子突变体的第3片叶中的禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）生长情况进行定量分析。每种情况均至少使用了四株独立的植株。

（D）CAP分析展示了接种了完整合成群落的玉米突变体和野生型W22植株的叶片微生物组组成投影情况。图中显示了置换多元方差分析（PERMANOVA）的R²值和p值。

（E）示意图模型解释了由微生物群驱动的对一组防御相关基因的抑制作用，这种抑制作用调节了单片叶子中生长与防御之间的权衡。

因此，我们评估了在低养分条件下接种了合成群落的野生型和突变植株的第3片叶对致病真菌禾谷镰刀菌感染的敏感性。之所以选用第3片叶，是因为在野生型植株中，未接种的植株和接种了合成群落的植株在对禾谷镰刀菌感染的易感性方面，第3片叶表现出了最大的差异（图5E和6C）。与野生型植株不同的是，在无菌条件下生长或接种了合成群落的突变植株，对病原体感染表现出了相似的敏感性（图6C）。此外，我们发现，这些调控基因的活性降低也在较低的分类水平上影响了叶片微生物群的组装（图6D、S6P和S6Q）。这些结果表明，由微生物群介导的对本文所鉴定的调控回路的转录抑制，在单片叶子水平上控制着生长与防御的权衡机制，从而有利于叶片的生长（图6E）。这种由微生物群驱动的机制可以解释在各种天然土壤中生长的植株所观察到的促进生长的表型。

作者简介

Valéria Custódio(第一作者)

Valéria是Castrillo实验室博士生和研究硕士（MRes）学生，她拥有阿威罗大学（葡萄牙）的生物学理学学士学位以及科英布拉大学（葡萄牙）的生物化学理学硕士学位。在攻读硕士学位期间，Valéria研究了从葡萄园分离出的植物病原菌与植物保护剂之间的相互作用，将其作为一种潜在的生物防治策略。

她在诺丁汉大学攻读研究型硕士期间的工作，主要集中在综合研究土壤矿物质含量、土壤微生物组组成、植物微生物群以及植物营养等方面，以理清影响玉米产量和矿物质含量的主要驱动因素。

Gabriel Castrillo(通讯作者)

Gabriel Castrillo的研究重点是理解在营养环境下植物与微生物之间是如何相互作用的。他研究微生物如何帮助植物应对营养缺乏的状况，以及植物如何影响根部和叶片微生物组的结构。

Gabriel之前师从北卡罗来纳大学教堂山分校Jeff Dangl实验室。2017年，他发表了自己的第一篇《Nature》杂志论文，随后在2020年又在《Nature》和《Science》杂志上发表了论文。Gabriel现任诺丁汉大学研究员，如今已晋升为副教授。

翻译：曾美尹，中国农科院基因组所硕士在读;

审核：朱志豪，广东医科大学，基因组所联合博士后;

终审：刘永鑫，中国农科院基因组所，研究员/博导;

排版：荀佳妮，中国农科院基因组所，生物信息学硕士在读

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来源：微生物组