摘要：然而，ctDNA的极低浓度使得检测MRD面临诸多挑战。此外，研究表明，利用新子（neomers）作为循环游离DNA（cfDNA）的生物标志物在MRD检测中同样展现出一定潜力

*仅供医学专业人士阅读参考

基于ctDNA和neomer特征的无创监测方法为NSCLC提供新的预后评估工具。

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是最常见的癌症死亡原因。非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌病例的80%-85%

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。因此，检测识别微小残留病灶（MRD）以促使早期预后评估并调整治疗方案显得尤为重要。

循环肿瘤DNA（ctDNA）作为由肿瘤细胞释放到血液中的非侵入性生物标志物，可用于预测疾病进展

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图1 研究封面

研究设计及方法

患者招募和样本收集

2018年5月至2020年11月期间，研究共纳入了59例NSCLC患者。研究采用的化疗放疗（CRT）方案是基于铂类的双药联合方案，包括顺铂加依托泊苷、卡铂加紫杉醇或顺铂加培美曲塞（仅限于非鳞状细胞癌）等组合。研究者在不同的时间点收集外周血样本，用于通过靶向下一代测序（NGS）分析474个与癌症相关的基因以及全基因组测序。

在排除了在血浆样本收集时出现疾病进展（PD）事件的患者以及因肝/骨转移或个人原因而接受化疗而非CRT/放疗（RT）的患者后，共获得了44例患者的治疗后血浆样本。研究者在患者PD前的三个不同时间点评估了血浆样本中的ctDNA状态：分别为治疗期间（TP1：CRT/RT的第四周）、治疗后里程碑（TP2：CRT/RT完成后1个月）以及治疗后纵向（TP3：CRT/RT完成后3个月）。具体来说，39例患者在TP1时，32例在TP2时，25例在TP3时接受了评估。除了ctDNA结果外，研究者还收集了详细的病理和临床反应数据，以供后续分析。患者中位随访时间为26.4个月。

Neomer机器学习模型

研究者对WGS数据的原始读取进行修剪，将处理后的读取与人类基因组（GRCh37/hg19）进行比对以去除来自参考基因组的常见变异。为构建模型，研究者采用了新定义的neomer特征。研究者还对PCAWG数据库进行了调查，从2577个癌症患者样本中识别出了977个重复出现的单核苷酸多态性（SNPs）。从这些重复的SNP中，我们提取了4616个长度为16个碱基对的neomer。随后，使用全基因组变异数据库（gnomAD v2）将这些neomers与常见的种群变异数据进行过滤，最终得到了1758个neomers。针对每个血浆样本，扫描FASTQ数据以寻找与1758个目标neomer的16 bp长度完全匹配的序列，并将neomer特征定义为neomer检测到的读取与总读取数量的比值，以及每个neomer的读取计数。

为了开发MRD预测模型，44例患者收集了总共97个血浆样本，包括39个TP1样本、33个TP2样本和25个TP3样本，如图1所示。针对每个时间点，采用生存支持向量机（sSVM）算法构建了三个机器学习模型。

图2 研究队列和设计流程图

三个模型均采用留一交叉验证（LOOCV）策略进行了性能评估。在LOOCV过程中，除了留出的第i个样本外，对整个数据集构建了N（TP1：39，TP2：33，TP3：25）个交叉验证模型。使用训练好的交叉验证模型，研究者为被排除的第i个样本预测MRD风险。在获取所有样本的风险评分后，通过选择一个截止值来确定MRD状态以确保90%的特异性。

关键研究结果

患者特征

MRD检测的机器学习模型

既往研究发现，在CRT后各时间点（TP1、TP2和TP3），复发患者的突变总读取比率显著高于未复发患者（见图3）。突变总读取比率是指突变读取数与总读取数的比例。此外，正如预期的那样，复发患者的癌症信号在TP1到TP3之间逐渐上升，并且在TP3时，复发患者与未进展患者之间存在统计学显著差异（p=0.025）。

图3 不同时间点的neomer特征模式

neomer模型在不同时间点均表现出一致的高性能。TP1时的模型敏感性为40%（95%Cl，21.1%–61.3%），特异性为92.9%（95%Cl，66.1%–99.8%）。TP2时模型的敏感性为40%（95%Cl，19.1%–63.9%），特异性为92.3%（95%Cl，64%–99.8%）。TP3时模型的敏感性为45.5%（95%Cl，16.7%–76.6%），特异性为92.9%（95%Cl，66.1%–99.8%）。

表1 neomer模型和基于突变的ctDNA方法的性能

此外，sSVM算法在三个时间点的表现均优于其他算法，均在目标90%特异性截止值下（如表2所示）。

表2 目标90%特异性下不同算法的性能评估

图4A显示模型能够提供稳定的预测效能。在TP1时，neomer模型显示出高风险患者的风险约为低风险患者的3.6倍（HR=3.62，95%Cl，1.49–8.81，p=0.0026）。在TP2时，该模型显示出风险约为3.9倍（HR=3.91，95%Cl，1.54–9.92，p总体而言，生存曲线显示，模型在不同时间点都能够保持区分高风险患者的能力（平均HR=3.84，标准差=0.19，见图4）。

图4 模型对于无进展生存期（PFS）的预测分析

图5 放射学确认复发前的neomer模型预测和ctDNA检测状态

将模型预测的结果与ctDNA突变分析的结果进行比较后发现，基于ctDNA变化的方法在TP1时敏感性为40%（95%Cl，21.1%–61.3%），特异性为78.6%（95%Cl，49.2%–95%）；TP2时敏感性为45%（95%Cl，23.1%–68.5%），特异性为100%（95%Cl，75.3%–100%）；TP3时敏感性为18.2%（95%Cl，2.28%–51.8%），特异性为85.7%（95%Cl，57.2%–98.2%）。

此外，模型与基于ctDNA突变的方法之间存在显著重叠，表明对高风险患者的预测具有相互一致性（如图6所示）。TP3时，neomer模型识别出6名高风险患者，而突变分析检测到4名ctDNA阳性患者，其中2名患者被两种方法均预测为高风险，neomer模型的敏感性比突变分析高出2.5倍（见表1）。此外，neomer模型在三个时间点与基于ctDNA突变的方法显示出良好的一致性，Cohen's Kappa值分别为TP1：0.2800（95%Cl，0–0.5979），TP2：0.5416（95%Cl，0.2189–0.8645），TP3：0.2574（95%Cl，0–0.6941）。

图6 提高检测疾病进展高风险患者的敏感性

在不同时间点，ctDNA阳性患者的复发风险显著波动：TP1时风险增加约2.1倍（HR=2.08，95%Cl，0.92–4.73，p=0.074），TP2时增加约9.5倍（HR=9.47，95%Cl，3.06–29.3，p相比之下，neomer模型预测的高风险患者风险更为稳定。

ctDNA突变分析在所有患者及三个时间点的表现均不及neomer模型。在所有患者中，neomer模型预测了19例高复发风险患者，而突变分析检出18例ctDNA阳性患者；在三个时间点的患者中，neomer模型预测6例高风险患者，突变分析检出7例ctDNA阳性患者，两者敏感性相似。在TP1和TP2时，neomer+突变因素是影响复发风险的最显著因素（TP1: p=0.007；TP2: p=0.004），但在TP3时不显著（p=0.117）。年龄在TP2时也是显著影响因素之一（p=0.013）。

此外，结合neomer模型和ctDNA突变分析的方法在三个时间点均提高了敏感性，同时保持了相似的特异性。联合模型在TP1、TP2和TP3的敏感性分别为60%、55%和54.5%，特异性分别为78.6%、92.3%和85.7%。联合方法的整体准确性在三个时间点均高于单独使用neomer模型或ctDNA突变方法，显示出临床应用上的潜力。

综合三个时间点的数据，联合模型的敏感性达到77.8%，特异性为70.6%，高风险患者的风险是低风险患者的4.51倍（HR=4.51，95%Cl，1.77–11.51，p=0.0007）。在三个时间点均有数据的19名患者中，联合模型的敏感性更是高达88.9%，特异性为80%，高风险患者的风险是低风险患者的13.37倍（HR=13.37，95%Cl，1.63–109.4，p=0.0022）。自助法分析（n=1000）进一步证实了整合模型在预测患者复发风险方面的优势和准确性。

研究意义与展望

总体而言，本研究基于无创液体活检技术，通过监测NSCLC患者CRT后的ctDNA，成功评估了其作为预后标志物的潜力。利用血浆样本中的neomer特征，研究开发了一种超灵敏测定法，为无法手术的局限性NSCLC患者提供了一种新的监测和复发风险评估手段。这种方法不仅无需预先获取肿瘤样本，而且通过结合neomer和机器学习模型，显示出优于传统突变检测的预测能力。

同时，研究存在样本量小和缺乏独立验证队列等局限性，期待未来通过增加样本量和建立多中心合作，克服当前研究局限，进一步增强预测模型的稳健性和适用性，旨在为NSCLC患者提供更全面和精准的预后信息参考。

来源：医学界肿瘤频道一点号