摘要：小麦条锈病是由禾本科锈菌的一种专化型——小麦条锈菌（Puccinia striiformisf. sp.tritici, Pst）引起的毁灭性病害，严重威胁全球小麦生产和粮食安全。与许多病原菌类似，Pst在侵染过程中会分泌大量效应蛋白（effectors）进入

小麦条锈病是由禾本科锈菌的一种专化型——小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici, Pst）引起的毁灭性病害，严重威胁全球小麦生产和粮食安全。与许多病原菌类似，Pst在侵染过程中会分泌大量效应蛋白（effectors）进入寄主细胞或细胞间隙，以抑制植物免疫反应、调控寄主代谢、促进自身定殖。因此，深入理解Pst效应蛋白的功能和变异机制，对于揭示条锈菌致病机理、开发持久有效的抗病策略至关重要。然而，由于Pst是专性寄生菌，无法离体培养，且缺乏高效稳定的遗传转化体系，导致对其效应蛋白的功能研究进展缓慢，目前仅有约50个Pst效应蛋白被实验鉴定。近年来，以AlphaFold2（AF2）为代表的人工智能工具在蛋白质结构预测方面取得了突破性进展，为大规模、高通量地研究缺乏实验结构信息的效应蛋白提供了可能。效应蛋白虽然在序列上可能高度多样化、快速进化，但在三维结构上往往相对保守，形成特定的结构家族（如卵菌中的WY结构域，多种真菌中的ToxA-like、MAX、LARS等结构）。因此，利用计算生物学方法预测并分析Pst效应蛋白的结构，有望揭示其结构特征、功能线索和进化规律。

大连理工大学生物工程学院的Mahinur Akkaya团队在PLOS Computational Biology杂志发表了题为“Computational studies reveal structural characterization and novel families of Puccinia striiformis f. sp. tritici effectors”的研究论文。该研究利用AlphaFold2对来自14个小麦条锈菌（Pst）不同生理小种或分离株（包括12个tritici专化型、1个大麦专化型hordei和1个未定专化型分离株）的15,201个预测效应蛋白进行了大规模结构预测和分析，成功获得了8,102个高可信度的效应蛋白结构模型，并对其进行了系统的序列和结构注释。研究揭示了Pst效应蛋白的序列和结构特征、保守基序、亚细胞定位模式，发现了结构比序列更为保守的普遍规律，鉴定出一个与抑制小麦免疫通路相关的新效应蛋白结构家族，并发现了Pst效应蛋白与其他病原菌效应蛋白存在结构相似性，暗示了趋同进化的可能性。

主要研究结果介绍

1. 大规模效应蛋白预测与结构建模

研究团队首先从14个Pst生理小种/分离株的21个蛋白质组（共357,396个蛋白）出发，通过生物信息学流程预测分泌蛋白（SignalP 6.0），排除跨膜蛋白和GPI锚定蛋白，再利用EffectorP 3.0预测效应蛋白，最终去冗余后获得了15,201个候选效应蛋白序列（图1A）。随后，利用AlphaFold2对其成熟肽（去除信号肽）进行结构预测。通过pTM和pLDDT评分过滤，最终获得了8,102个具有高可信度结构预测结果的效应蛋白模型（图1B, 1C）。这表明约有一半的预测效应蛋白结构未能被AF2可靠预测，可能原因包括这些效应蛋白具有高度的菌株特异性，缺乏足够的同源序列和结构模板用于建模，或者其本身包含较多的固有无序区。成功预测的8,102个效应蛋白，其序列长度主要集中在101-250个氨基酸之间（图1D），符合效应蛋白的典型特征。

2. 序列与结构聚类分析

研究人员对8,102个效应蛋白进行了序列聚类（CD-HIT, 0.5阈值）和结构聚类（Foldseek, 0.5阈值），分别获得了1,005个序列簇和410个结构簇（S4 Table）。聚类热图和主成分分析（PCA）显示，序列簇和结构簇的分布在不同Pst小种/分离株间表现出一定的一致性，表明相似序列倾向于形成相似结构（图1E-H）。例如，来自中国的小种CYR32和来自美国的PST-78在效应蛋白组成上（序列和结构簇）表现出较高的相似性。有趣的是，尽管寄主不同，来自中国的CYR34（侵染小麦）和来自美国的大麦条锈菌93TX-2（侵染大麦）在效应蛋白的序列和结构组成上也存在相似性（图1E-H）。

3. 效应蛋白的序列特征和亚细胞定位

对8,102个效应蛋白成熟序列的分析显示，富含半胱氨酸是其显著特征之一，其中1,970个含有6个半胱氨酸，甚至有17个效应蛋白含有超过30个半胱氨酸（图2A），这些半胱氨酸可能形成二硫键以稳定结构，帮助效应蛋白在寄主环境（如含有蛋白酶的质外体）中维持功能。经典的效应蛋白基序分析发现，约47%的效应蛋白含有[Y/F/W]xC基序（常见于锈菌和白粉菌效应蛋白），约5.8%含有RxLR基序（常见于卵菌效应蛋白），此外还检测到[L/I]xAR、G[I/F/Y][A/L/S/T]R和YxSL[R/K]等已知与效应蛋白功能相关的基序（图2B, S4 Table）。不同工具的亚细胞定位预测结果虽有差异，但总体趋势表明，大部分Pst效应蛋白被预测为定位于细胞质，其中叶绿体和细胞核是重要的潜在作用位点（图2C, S4 Table）。

4. 基于结构的效应蛋白功能注释

研究利用Foldseek将预测的8,102个效应蛋白结构与三大结构数据库（CATH, PDB, SCOP）进行比对。结果显示，高达75%（6,110个）的效应蛋白获得了结构注释信息，显著高于基于序列注释的比例（约21%）（图2D, 2E, S4 Table）。这表明基于结构的同源搜索能更有效地为功能未知的效应蛋白提供线索。在CATH、PDB和SCOP数据库中，注释频率最高的结构域/蛋白分别为免疫球蛋白结构域、Hce2结构域蛋白（或称Zt-KP4-1）和膜融合ATPase p97 N端结构域。值得注意的是，超氧化物歧化酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶同时出现在序列注释（Pfam）和结构注释（PDB, SCOP）的热点中，暗示这些蛋白可能在Pst中扮演重要角色。

5. 结构比序列更保守及结构簇网络分析

通过比较序列簇和结构簇的对应关系，研究发现同一序列簇的效应蛋白绝大多数落入同一个结构簇，符合“序列相似则结构相似”的预期（S5 Table）。然而，反过来一个结构簇往往包含来自多个不同序列簇（序列相似度

6. 已鉴定Pst效应蛋白的同源物分析与新结构家族的发现

研究将8,102个预测结构与已报道的约50个Pst效应蛋白和5个来自近缘种秆锈菌（Pgt）的Avr蛋白（AvrSr50, AvrSr35等）进行了序列和结构比较（图4A, 4B, S2 Table）。结果显示，基于结构的比较能够鉴定出比基于序列的比较多得多的同源物。例如，唯一具有实验解析结构的Pst效应蛋白Pst_13661，其结构同源物广泛存在于多个Pst小种中（图4B, 4C）。特别地，研究发现三个已知靶向小麦关键免疫通路蛋白（TaRaf46, TaCZSOD2, TaGAPDH2, TaSGT1）的效应蛋白Pst27791、PstGSRE4和PstSIE1，虽然它们之间序列相似性不高，但它们的预测结构以及Struc.C_22和Struc.C_62中的大量其他效应蛋白，共同形成了一个以四螺旋束为核心结构的新结构家族（图4D）。这提示Pst中存在一类广泛分布的、具有相似四螺旋核心结构的效应蛋白，它们可能通过靶向不同的寄主免疫蛋白来协同抑制小麦的防御反应。

7. 与其他病原效应蛋白的结构相似性：趋同进化的证据？

研究还比较了Pst效应蛋白与来自其他病原（细菌、卵菌、其他真菌）的已知结构效应蛋白的相似性（S1 Table）。尽管序列比对未发现同源性，但在结构层面发现了显著的相似性。值得注意的是，来自Pgt的AvrSr35和AvrSr50与多个Pst效应蛋白结构簇（主要集中在Struc.C_2和Struc.C_21）的成员展现出结构相似性（图5A-C），这些Pst效应蛋白可能是潜在的、对应特定Yr抗病基因的Avr候选蛋白。此外，来自叶斑病菌的效应蛋白Zt-KP4-1（即Hce2结构域蛋白）与Struc.C_1和Struc.C_10中高达48%的Pst效应蛋白结构相似，且一些Pst效应蛋白甚至形成了Zt-KP4-1结构的串联重复（图6A, 6B）。更为显著的是，来自稻瘟病菌的MoHrip2蛋白结构与Struc.C_66的所有成员高度相似，且这种相似性仅限于该结构簇（图6A, 6C）。这些跨越物种界限的结构相似性，暗示了不同病原体可能进化出了结构相似但序列不同的效应蛋白，去靶向寄主中保守的关键节点或通路，这是一种趋同进化的策略。

全文总结与展望

本研究首次对小麦条锈菌Pst效应蛋白组进行了大规模的计算结构预测和系统分析，成功获得了超过8,000个高可信度的效应蛋白结构模型。通过整合序列和结构信息，研究揭示了Pst效应蛋白的关键特征，包括长度分布、富含半胱氨酸、保守基序模式、亚细胞定位倾向等。研究证实了在Pst效应蛋白中结构比序列更为保守的普遍规律，并通过结构聚类和网络分析揭示了不同结构家族的演化关系。

该研究最重要的贡献在于：（1）发现了一个由Pst27791、PstGSRE4、PstSIE1等代表的、以四螺旋束为核心的、广泛存在的新Pst效应蛋白结构家族，并将这些结构与已知的寄主免疫抑制功能联系起来；（2）发现了Pst效应蛋白与多种其他病原（包括近缘的Pgt以及远缘的稻瘟病菌、叶斑病菌等）的效应蛋白存在显著的结构相似性，为效应蛋白的趋同进化提供了有力证据。

这些发现不仅为深入理解Pst的致病机制和进化动态提供了宝贵的结构生物学视角和数据资源，也为未来效应蛋白的功能研究（特别是对缺乏序列同源性的蛋白）指明了方向。基于结构的同源性分析大大扩展了潜在的功能注释范围，并为筛选潜在的Avr候选基因和广谱抗病靶点提供了新思路。然而，本研究的结构均基于计算预测，仍需实验验证。未来的研究应聚焦于：（1）实验解析关键效应蛋白（尤其是新家族成员和趋同进化代表）的结构；（2）通过基因沉默、蛋白互作、细胞生物学等方法验证这些效应蛋白的功能及其靶向的寄主通路；（3）结合群体基因组学数据，探究这些结构家族在Pst种群中的变异和适应性进化。这些工作将有助于最终实现对小麦条锈病的有效、持久控制。

研究团队与资助

该论文的共同第一作者是Raheel Asghar和Nan Wu，通讯作者是Mahinur Akkaya*。所有作者均来自大连理工大学生物工程学院。

本研究工作得到了大连理工大学的经费支持 (DUT18RC(3)050)。

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来源：新浪财经