摘要：苯胺类化合物作为关键结构单元，普遍存在于药物分子及其他活性物质中，同时是多种工业材料制备的核心中间体。透明度市场研究（Transparency Market Research）发布的《2021-2031年全球苯胺衍生物市场预测报告》显示，到2031年，全球苯胺

苯胺类化合物作为关键结构单元，普遍存在于药物分子及其他活性物质中，同时是多种工业材料制备的核心中间体。透明度市场研究（Transparency Market Research）发布的《2021-2031年全球苯胺衍生物市场预测报告》显示，到2031年，全球苯胺类衍生物的市场价值将达到110亿美元。因此，开发芳胺骨架的高效合成方法在药物开发和材料科学等领域至关重要。传统的苯胺类化合物的工业合成工艺主要以苯或其衍生物出发，通过苯环硝基化反应以及随后的硝基苯催化加氢获得苯胺。在医药中间体合成领域，过渡金属催化的C–N键偶联反应同样被广泛应用，这类方法的发展对于药物分子的构建具有关键意义。尽管这些经典方法目前仍无可替代，科研工作者持续致力于探索更加绿色温和、可持续的合成体系，从而最终避免使用高温高压的反应条件，或者高成本且具有生理毒性的过渡金属催化剂。本研究聚焦生物酶催化体系的开发，通过定向进化初步验证了该策略合成苯胺类化合物的可行性。值得注意的是，相较于自然界中存在的基于P450体系的苯胺合成酶，这一生物催化体系展现出截然不同的催化机制，为酶催化在苯胺合成领域的应用提供了新的突破方向。

4月7日，清华大学生物医学交叉研究院刘臻课题组在《德国应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）发表了题为“氧化胺化合成苯胺的酶促平台”（An Enzymatic Platform for Aniline Synthesis through Oxidative Amination）的研究论文。通过改造该实验室开发的黄素（FMN）依赖酶PtOYE（源自Parageobacillus thermantarcticus），这一催化体系可以有效地将胺类化合物和环己酮衍生物组合，通过氧化胺化的机制制备多种二级和三级苯胺。针对结构不同的胺类底物，研究人员分别通过两条定向进化路径获得了各自的优势突变体OYE_G3和OYE_M3，提高了酶催化的效率并抑制了环己酮直接脱氢生成苯酚的副反应。通过多组动力学实验，研究人员系统研究了这类苯胺合成酶的催化机制。实验表明，优势突变体不仅提高了亚胺中间体芳构化的催化效率，且降低了环己酮直接脱氢生成苯酚的活性，形成了有利于目标反应的协同效应。

图1.苯胺类化合物的生物合成新策略

研究初期，研究人员首先对野生型黄素酶及其突变体的亚胺脱氢芳构化活性进行了系统性筛选。实验数据显示，课题组现有酶库中的OYE_G0突变体对于目标反应具有显著的初始活性，能够以最高的转化率（38%）催化生成目标产物3aa且目标产物与副产物4a的比例最优，体现了这类脱氢酶具有被进一步优化的潜力。

基于这一发现，研究人员随后利用OYE_G0作为起始模版，分别针对二级苯胺和三级苯胺的合成过程进行了多轮蛋白质工程化改造与筛选。通过多个活性位点的定点饱和突变以及随机突变，研究人员最终分别获得催化合成二级苯胺的突变体OYE_G3以及催化合成三级苯胺的优势突变体OYE_M3。

图2.针对二级与三级苯胺分别开展的蛋白质工程化改造

在确定了最优酶突变体和最适反应条件之后，研究人员系统地研究了这些苯胺合成酶的底物适用范围。结果表明，这种生物催化方法展示出了良好的底物兼容性和官能团耐受性，可以将不同取代的苄胺、含杂环的伯胺以及部分烷基胺转化为相应的二级苯胺；也可成功地将部分仲胺转化为三级苯胺。此外，不同取代模式的环己酮也能参与反应。在此基础上，研究人员选取多个底物进行了制备规模的酶促反应，成功合成出如3ad、3ao等多种苯胺衍生物，进一步验证了该方法的应用潜力。

图3.底物适用性拓展与部分放大试验

为了深入了解这一酶促反应的机理，研究人员对生物催化脱氢偶联反应进行了一系列动力学研究。首先，研究人员使用二级苯胺合成酶进化谱系中的各个变体针对3aa的酶催化合成进行了时间进程实验，并通过Michaelis-Menten曲线分析酶的动力学参数。实验结果表明定向进化引入的突变有效地提高了苯胺合成酶OYE_G3的kcat。随后，研究人员用类似的方法对三级苯胺3ca的合成反应进行了时间进程研究。与二级苯胺合成体系不同的是，三级苯胺合成反应的前期会发生可逆的aza-Michael加成过程形成中间体6b，因此反应会显示出明显的诱导期（induction period）。为了明确探究酶活性是否从环己酮脱氢转移到亚胺脱氢，研究人员比较了最初变体（OYE_G0）与定向进化谱系的两个最终变体（OYE_G3和OYE_M3）生成苯酚的活性变化（图4e和4f）。实验结果表明，进化后的变体对于苯酚生成过程的催化能力显著下降。

图4.苯胺合成酶系统的动力学研究

图5.酶催化苯胺合成反应的推测过程

基于黄素依赖酶的独特脱氢催化机制，研究人员开发了非天然的苯胺合成酶系统，可以有效地制备二级与三级苯胺衍生物。这种酶催化系统可以通过后续的进化进一步提高催化效率，并通过计算与实验结合的方式完善机制研究。总体而言，这项工作为苯胺化合物的合成提供了高效、环境友好的生物合成策略，在生物催化和药物开发等领域具有重要的应用前景。

清华大学生物医学交叉研究院研究员刘臻为论文的通讯作者，刘臻实验室联合培养博士生赵翔为论文的第一作者。研究得到科技部、清华大学生物医学交叉研究院以及北京生命科学研究所的支持。

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来源：清华大学一点号